[发明专利]一种α-葡萄糖转苷酶突变体及其应用

说明书

本发明涉及一种α‑葡萄糖转苷酶突变体，属于基因工程技术领域。所述α‑葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。本发明在深海地衣芽孢杆菌来源α‑葡萄糖转苷酶的基础上，筛选获得两株单点热稳定性提高的突变菌株S204L，A307E以及一株组合突变体S204L/A307E，且突变体在热稳定显著提高的同时，酶的活性不受影响。本发明中的这些突变体比天然α‑葡萄糖转苷酶更适用于工业生产，具有非常巨大的应用前景和产业价值。

技术领域

本发明涉及一种α-葡萄糖转苷酶突变体及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

低聚异麦芽糖(isomaltooligosaccharides，IMOs)是一类功能性低聚糖，由2～10个α-1、6-糖苷键连接的葡萄糖基组成，包括异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖等主要功能成分。IMOs可促进双歧杆菌和乳酸杆菌等益生菌在人体肠道中的增殖，调节肠道菌群；有低热量值，促进胃肠蠕动，改善便秘和脂质代谢，防龋齿等功能，因此，IMOs被广泛用作益生素、食品添加剂和饲料成分。

目前，一般通过酶促转化的方法生产IMOs，利用α-淀粉酶、β-淀粉酶、普鲁兰酶和葡萄糖苷酶从淀粉中催化生产，其典型的生产过程通常包括3个步骤：一是液化，其中淀粉被耐热α-淀粉酶液化产生低聚糖和糊精；二是糖化，低聚糖和糊精被β-淀粉酶和普鲁兰酶等糖化酶糖化；三是转糖基化，α-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.20)可催化葡萄糖从底物的非还原末端释放，并将葡萄糖基残基转移到非还原葡萄糖单位的6-OH基团，产生IMOs。目前，商业α-淀粉酶，β-淀粉酶和普鲁兰酶等的研究及工业应用较为成熟，而工业上应用的α-葡萄糖苷酶大多来源于黑曲霉(Aspergillus niger)，由于热稳定性差、反应速率不高和酶纯化及回收利用成本高等问题，限制了α-葡萄糖苷酶在规模化生产IMOs上的应用。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种热稳定性提高的α-葡萄糖苷酶突变体。

技术方案

一种α-葡萄糖苷酶突变体，是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的α-葡萄糖转苷酶的第204位和/或第307位的氨基酸进行定点突变获得的，其中，将第204位的丝氨酸突变为亮氨酸，第307位的丙氨酸突变为谷氨酸，所述α-葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列如SEQID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示；编码所述α-葡萄糖转苷酶的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。

上述α-葡萄糖苷酶突变体用于生产低聚异麦芽糖的应用。

一种制备上述α-葡萄糖苷酶突变体的方法：

(1)以SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为模板，根据突变的位点，设计定点突变引物，进行PCR扩增获得含有突变位点的基因，然后构建含有编码突变体基因的载体。

(2)将含有编码突变体的基因载体转化到宿主细胞内。

(3)对上一步构建的重组细胞进行筛选验证，获得阳性克隆，然后通过培养发酵产酶，离心收集细胞，利用超声波细胞破碎仪破碎细胞，离心，获得α-葡萄糖转苷酶突变体。

一种编码上述α-葡萄糖苷酶突变体的基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。

一种携带上述基因的重组表达载体。

所述重组表达载体以pET-28a(+)载体作为原始表达载体。

一种由上述重组表达载体转化得到的基因工程菌。

所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主。所述大肠杆菌包括BL21(DE3)。

本发明的有益效果：