[发明专利]一种用于检测微囊藻毒素-LR的试纸检测方法

说明书

本发明属于生物传感器及环境监测领域，公开了用于检测微囊藻毒素‑LR的试纸检测方法。该试纸检测方法包括：构建磁珠‑DNA探针；将磁珠‑DNA探针与待检测水样混合；磁分离Blocker链；构建CRISPR‑Cas12a系统；采用试纸检测。当MC‑LR存在时，磁珠‑DNA探针上的DNA双链Probe中的Blocker链与MC‑LR竞争结合Aptamer，进而释放Blocker链，释放的Blocker链与Cas12a‑crRNA结合，可激活CRISPR‑Cas12a系统的核酸酶活性，从而非特异性切断信号链Reporter链，断裂的Reporter链可让试纸的T线显色。该试纸检测方法对MC‑LR具有高特异性和灵敏性，并且成本低廉，可用于真实环境水样的检测。

技术领域

本发明属于生物传感器及环境监测领域，具体涉及一种用于检测微囊藻毒素-LR的试纸检测方法。

背景技术

随着水体富营养化的逐步加剧，蓝藻水华和赤潮的发生逐步增加。越来越多的水源受到蓝藻水华的次生代谢产物-微囊藻毒素(MCs)的污染，对水体环境和人群健康构成巨大的威胁。而微囊藻毒素-LR(MC-LR)是其中最普遍、最具毒性的微囊藻毒素同源物，能够强烈抑制蛋白磷酸酶的活性，还是强烈的肝脏肿瘤促进剂。考虑到其强毒性，中国生活饮用水卫生标准(GB 5749-2006)的颁布，将饮用水中微囊藻毒素含量限制为1μg/L。因此，在水环境中监测MC-LR对环境安全与人体健康至关重要。

检测MC-LR的传统方法包括高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱与质谱联用(LC-MS)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白磷酸酶抑制试验(PPIA)、以及光学和电化学传感器。HPLC-MS虽然有较高的灵敏度和特异性，但是其需要庞大而昂贵的机器设备，这对现场检测MC-LR造成了一定的阻碍。ELISA和PPIA虽然利用了酶的特异性，然而其需要多步骤冗长的检测过程。电化学传感器虽然有极灵敏的检测效果，但是需要合适的电极材料以及适宜的电极修饰。光学传感器操作简单，但是也受到了灵敏度和特异性的限制。

通过查阅文献知道，原核生物已经开发出一种成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)的适应性免疫系统。过去的几年里，CRISPR-Cas9酶经过各种重新设计，引起了基因编辑热潮。而CRISPR-Cas12a是一种新的RNA引导的核酸酶，正在成为基因编辑最常用的工具，其对DNA识别的特异性、灵敏性和可编程性在分子诊断领域备受关注，做为一些强大诊断工具的核心，其有望解决生物传感器在灵敏度和特异性等方面的问题。

传统的抗原-抗体反应灵敏度、特异性均好，但是蛋白质做为探针分子容易变性，而且价格昂贵，适配体由DNA分子构成，经SELEX富集筛选，可以具有与抗原-抗体相匹敌的灵敏度，同时更易合成，稳定性更好。所以我们在生物传感器的基础上，结合DNA适配体的特异性、酶的特异性，构建出一种操作简单同时高灵敏度的MC-LR检测平台,同时通过对信号链的设计，利用侧向流动试纸条直接检测MC-LR，操作简单，省去现场检测时机器设备带来的不便。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种用于检测微囊藻毒素-LR的试纸检测方法，该试纸检测方法通过构建一种可用于现场检测微囊藻毒素-LR的磁珠-DNA探针，并通过CRISPR-Cas12a进行信号识别和放大，从而实现水样监测，该法具有高特异性和灵敏性，并且成本低廉，操作步骤简便。

本发明提供了一种用于检测微囊藻毒素-LR的试纸检测方法，包括以下步骤：

S1.将适配体Aptamer和互补链Blocker加入TAMg缓冲液中混合摇匀得反应液，将所述反应液95℃加热5min，然后逐渐冷却至4℃，形成DNA双链Probe；

所述适配体Aptamer的序列如SEQ NO.1所示，所述适配体Aptamer的一端修饰有生物素Biotin，所述互补链Blocker的序列如SEQ NO.2所示；