[发明专利]能够以甲醇为唯一碳源产脂肪酸工程菌的构建方法及其应用

说明书

本申请公开了一种能够以甲醇为唯一碳源产脂肪酸工程菌的构建方法。所述构建方法包括：敲除高产脂肪酸汉逊酵母工程菌株的LPL1基因和IZH3基因。所述构建方法通过敲除LPL1基因和IZH3基因，可以使得高产脂肪酸工程菌能够以甲醇为唯一碳源产脂肪酸。

技术领域

本申请涉及一种能够以甲醇为唯一碳源产脂肪酸工程菌的构建方法，属于微生物基因工程和代谢工程应用领域。

背景技术

甲醇含有碳、氢两种元素，既能看作氢载体，碳元素还能用来合成多种化学品。其液态特性利于储存与运输，能够与现有石油化工基础设施对接，被看作一种具有潜力的化工原料。甲醇可以由煤炭、天然气以及可再生生物质进行制备(Energy,2014,77,125)，特别是，近年来提出了“液态阳光”路线，CO₂直接加氢获得甲醇(Science,2017,355,1296)，将能保证甲醇原料稳定供给。因此，建立甲醇高效转化路线是保证未来能源及化学品需求的可行路径。生物合成系统(酶及微生物细胞)选择性好，过程绿色，条件温和，能合成结构更加复杂的含氧化学品以及能量密度更高的液体燃料。因此，生物系统与化工路线互为补充，有望成为甲醇高效转化的另一可行路径，推动我国煤炭及一碳资源洁净利用(NatureEnergy,2018,3,925.)。

利用微生物细胞工厂生产大宗化学品、生物燃料以及天然产物等目标产物是一种可持续的生产模式。因此，以能够利用甲醇为底物的微生物为宿主构建细胞工厂是实现高效甲醇生物转化的重要研究方向。自然界中，存在一类“甲基营养型”微生物能够利用C1化合物(甲烷、甲醇等)为碳源进行生长代谢，其主要包括一些原核细菌以及甲醇酵母(巴斯德毕赤酵母和多形汉逊酵母等)。其中，多形汉逊酵母具有底物谱广泛(葡萄糖、木糖和甲醇等)、耐高温(50℃以上)以及副产物少和易于高密度发酵等诸多优良特性，是一种优良的细胞工厂底盘细胞(FEMS Yeast Research,2012,12,271)。但是，缺乏高效遗传操作工具严重阻碍了汉逊酵母的应用与发展。发明人前期工作构建了相对完善的汉逊酵母遗传操作平台，实现了方便、快速的精准基因组编辑和代谢调控，为构建高效汉逊酵母细胞工厂奠定了良好基础(iScience,2021,24,102168)。

目前针对于甲基营养型微生物的研究主要着眼于构建并强化上游甲醇利用途径，普遍认为如果细胞能够高效同化甲醇，就能实现目标产物的高效合成。但是，我们发现高产脂肪酸的汉逊酵母工程菌株无法在以甲醇为唯一碳源的基础培养基中进行生长。这一现象说明在甲基营养型微生物中，甲醇利用过程中细胞生长与产物合成可能存在相互竞争的关系，也就是说，甲醇代谢通量可能无法同时满足细胞生长与产物合成，但相关分子机制并不清楚。因此，了解这一竞争关系并解析相关分子机制，将有望推动天然甲基营养型微生物细胞工厂研究进展，提高天然/合成甲基营养型微生物甲醇利用效率，真正实现高效甲醇生物转化合成多种高附加值的目标产物。

因此，本发明旨在获得一株能够高效利用甲醇并高产脂肪酸的汉逊酵母菌株。在faa1Δ的汉逊酵母底盘细胞中，借助实验室适应性进化，对驯化菌株进行多组学测序，揭示甲醇同化时脂质代谢和细胞生长竞争的分子机制。在驯化菌株中鉴定了两个关键突变基因LPL1和IZH3，其双突变能够有效缓解细胞由脂肪酸积累和甲醇代谢导致的细胞毒性，并能够提高野生型细胞高浓度甲醇耐受能力。最终，在驯化菌株中进行的全局代谢途径重构增加了乙酰辅酶A和NADPH供给，使得脂肪酸产量达到15.9g/L，证明了汉逊酵母作为细胞工厂的应用潜力。

发明内容

根据本申请的一个方面，提供一种能够以甲醇为唯一碳源产脂肪酸工程菌的构建方法，所述构建方法通过敲除LPL1基因和IZH3基因，使得高产脂肪酸工程菌能够以甲醇为唯一碳源产脂肪酸。

能够以甲醇为唯一碳源产脂肪酸工程菌指的是所述工程菌能够以甲醇为唯一碳源产脂肪酸，即能够在仅含有甲醇碳源的培养基中生产脂肪酸，但并不排除其也能够利用别的碳源产脂肪酸。

一种能够以甲醇为唯一碳源产脂肪酸工程菌的构建方法，所述构建方法包括：