[发明专利]利用CRISPR/Cas9技术获得木质素缺陷株型杂交构树的方法

说明书

本发明公开了一利用CRISPR/Cas9技术获得木质素缺陷株型杂交构树的方法，属于植物基因工程技术领域，首先构建CRISPR/Cas9基因敲除载体质粒，热激发将载体质粒转到EHA105农杆菌中制备侵染液，将杂交构树叶子浸泡到侵染液里，真空抽滤5‑8min；吸干侵染液，置于共培养基N6AS共培养两天；将叶子转移到筛选培养基MS5中诱导；将长出的愈伤转移到分化培养基WPMD诱导；将诱导出来的芽转移到生根培养基MS0诱导；当树苗长到6‑8cm高，加入抑菌水，开盖炼苗6‑8天，冲洗掉培养基，在加入生根粉的水里浸泡，然后转移到透气湿润的土里进行种植。本发明在杂交构树中敲除F5H蛋白编码基因，其蛋白表达量活性降低或失活，杂交构树S型木质素单体素含量降低，牧草消化率升高。

技术领域

本发明属于植物基因工程和基因组编辑技术领域，特别涉及 CRISPR/Case9系统对杂交构树基因定点突变的方法，F5H蛋白在调控杂交构树株型中的应用。

背景技术

杂交构树(Broussonetia papyrifera L.)为桑科构树属落叶乔木，又名鹿仔树等，是构树杂交出的优良种，广泛分布于我国大部分温带以及热点地区。杂交构树的对于干旱、盐碱等特殊恶劣环境有着极强的适应性性，并且能够快速生长，是我国理想的用于城市绿化以及退耕还林治理土地荒漠化的树种。除此之外，杂交构树还是是我国分成重要的经济林木之一，其树皮所含有的纤维品质优良，可广泛用于造纸及创制新型纺纱材料；其树叶可以治疗小鼠肥硕，主要通过能促进小鼠体内的油脂减少，从而改变内脏脂肪变性达到治疗的目的，并且其叶还可以代替苜蓿(牧草之王)草粉和豆粕，作为添加在猪牛羊等家畜的青贮饲料；从其叶提取出的汁液有效地杀死昆虫，人们可以避开化学合成的污染环境的杀虫剂，从构树叶中提纯开发出天然植物生物杀虫剂。基于以上的杂交构树优良性状，通过遗传转化方法对这些特性的深入研究，以及发利用具有非常重要的生产现实意义。

木质素(lignin)主要沉积在植物的次生细胞壁中，是木本植物的主要成分之一的芳香族多聚物。木质素由三种单体构成，分别为紫丁香基木质素(syringyl lignin，S-木质素)、愈创木基木质素(guaiacyl lignin，G-木质素)和对-羟基苯基木质素(hydroxy-phenyl lignin，H- 木质素)。阿魏酸-5-羟基化酶F5H(ferulate-5-hydroxylase)催化阿魏酸、松柏醛和松柏醇发生羟基化，同时产生芥子酸，从而合成S-木质素。因此，F5H是在苯丙素代谢过程中S-木质素合成的关键基因。对F5H基因进行改造，有利于在木质素含量不变的情况下，改变木质素组分含量，提高制浆效率，减少对环境的污染，积极响应国家大力倡导的可持续发展，进而达到林木市场经济的发展和保护环境共赢的局面。

CRISPR/Cas9基因组编辑技术是当下非常热门分子育种工具，是由向导RNA(sgRNA)和Cas9蛋白两部分构成。sgRNA对靶位点DNA 进行定向识别，后结合的Cas9蛋白进行切割，切割后DNA自我修复不能恢复。目前CRISPR/Cas9基因组编辑技术，因为其更精准，更高效的优点，广泛的应用于植物分子育种之中。

目前没有研究表明已经获取了杂交构树的F5H纯合编辑和F5H 过表达转基因株系。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术在杂交构树上快速、高效的获得木质素缺陷株型的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供CRISPR/Cas9基因组编辑技术在杂交构树上进行应用方法和过程，本发明提供蛋白质调控基因的表达的物质在调控杂交株型中的应用，所述基因编码相应F5H蛋白质；

为了实现上述发明的目的，本发明的技术方案如下：

利用CRISPR/Cas9技术获得木质素缺陷株型杂交构树的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)从文献中获取杂交构树F5H基因序列，设计引物，获得具体杂交构树F5H基因序列；