[发明专利]利用CRISPR/Cas9技术获得木质素缺陷株型杂交构树的方法

权利要求书

1.利用CRISPR/Cas9技术获得木质素缺陷株型杂交构树的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

(1)从文献中获取杂交构树F5H基因序列，设计引物；

BPF5H-F:ATGGATACCAAAAGTATCACCTCC

BPF5H-R:TCAGATGGTGCACACGACACGT

(2)根据已经获得的构树BpF5H基因序列，以及CRISPR载体设计原则，选取的三个靶位点分别为‘ATCCCCCTCCTCTTCCTCCT’,‘ATCATCGGGAGCATGTCGAT’,‘TCAGGTACCTGACGTACGAC’；

(3)选定靶位点后，使用高保真酶对片段进行PCR扩增，设计不同靶位点相应的引物，以包含tRNA和sgRNA序列的pGTR载体为模板；PCR扩增并进行胶回收获得200bp的片段，然后取出PCR反应产物进行胶回收；引物序列如下：

BrF5H-tRNA-CRISPR-35S-B-1:TAGGTCTCAGTCAAACAAAGCACCAGTG；

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA1-2:GCGGTCTCAGAGGAGGGGGATTGCACCAGCCGGGAA；

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA1-3:TAGGTCTCACCTCTTCCTCCTGTTTTAGAGC；

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA2-4:GCGGTCTCAGAGCATGTCGATTGCACCAGCCGGGAA；

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA2-5:TAGGTCTCAGCTCCCGATGATGTTTTAGAGCTAGAAA；

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA3-6:GCGGTCTCACTGACGTACGACTGCACCAGCCGGGAA；

BrF5H-tRNA-CRISPR-sgRNA3-7:TAGGTCTCATCAGGTACCTGAGTTTTAGAGCTAGAAA；

BrF5H-tRNA-CRISPR-35S-B-8:TAGGTCTCAAAACAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCC；

(4)回收的目的片段通过一步法连接T4连接酶，连接反应产物转入DH5α，鉴定阳性克隆并测序，将测序结果和已经报道的序列对比，将测序正确的菌落培养后提取CRISPR/Cas9-BpF5H载体质粒并在-20℃保存；

(5)采集杂交构树的叶子，叶子大小为4.5-5.5cm，使用7％的次氯酸钠消毒10min，用无菌水清洗至无菌、无消毒剂残留，吸干水分；

(6)提前制备侵染液：热激发将步骤(4)制备的载体质粒转到EHA105农杆菌中，筛选出阳性菌落，置于-80℃冰箱备用；取出菌液与相应抗生素LB中摇菌，当OD₆₀₀＝0.4-0.5时加100μmol·L^–1乙酰丁香酮，2h后离心富集菌液，使用N6侵染液重悬为OD₆₀₀＝0.2-0.3，侵染液制备完成；所述N6侵染液是N6基础培养基中含有终浓度为30g·L^-1蔗糖，100μmol·L^–1乙酰丁香酮，pH值为6；

(7)将步骤(5)处理的叶子剪成1cm小块浸泡到制备好的侵染液中，同时真空抽滤5-8min；将侵染液吸干，置于共培养基N6AS共培养两天；所述共培养基N6AS是N6基础培养基中含有终浓度为30g·L^-1蔗糖，7.8g·L^-1琼脂，100μmol·L^–1乙酰丁香酮，pH值为6；

(8)将没有出现霉菌和细菌的叶子转移到筛选培养基MS5诱导愈伤组织1.5-2个月；所述MS5培养基是MS基础培养基中含有终浓度为30g·L^-1蔗糖，7.8g·L^-1琼脂，4mg·L^–1 2,4-D，0.15mg·L^–1 6-BA，300mg·L^–1特美汀，1.5mg·L^–1bialaphos/3mg·L^–1潮霉素B，pH值为6；

(9)将步骤(8)长出的愈伤组织转移到分化培养基WPMD诱导再生芽1.5-2个月；所述的分化培养基WPMD是WPM基础培养基中含有终浓度为30g·L^-1蔗糖，7.8g·L^-1琼脂，0.5mg·L^–1 6-BA，0.05mg·L^–1NAA，0.04mg·L^–1TDZ，300mg·L^–1特美汀，1.5mg·L^–1bialaphos/3mg·L^–1潮霉素B，pH值为6；

(10)将步骤(9)诱导出来的再生芽转移到生根培养基MS0诱导芽生根2-3周；

所述的生根培养基MS0是MS基础培养基中含有终浓度为15g·L^-1蔗糖，7.8g·L^-1琼脂，0.5mg·L^–1NAA，0.5mg·L^–1IBA，300mg·L^–1特美汀，pH值为6；

(11)当步骤(10)已经生根的树苗长到6-8cm高，加入抑菌水，打开培养容器的盖子炼苗6-8天，冲洗掉培养基，在加入生根粉的水里浸泡25-35min，然后转移到透气湿润的土里；用保鲜膜盖上，待观察构树长出新叶新枝，揭去保鲜膜。