[发明专利]一种普卡那肽的制备及纯化方法

说明书

本发明公开了一种普卡那肽的制备及纯化方法，属于多肽合成技术领域，具体涉及将半胱氨酸与二苯基乙醛反应生成半胱氨酸衍生物，然后将半胱氨酸衍生物与Fmoc‑OSu反应得到Fmoc‑(R)Cys‑OH；将Fmoc‑Leu‑OH试剂与Wang树脂偶联，然后按普卡那肽的氨基酸顺序依次偶联氨基酸类试剂，Fmoc‑(R)Cys‑OH为偶联的第五个氨基酸类试剂，偶联得到十肽树脂时，氧化得到初环，偶联剩余氨基酸类试剂后，切割，再次氧化，并经纯化后得到普卡那肽。本发明方法具有普卡那肽制备收率高、纯度高的效果。

技术领域

本发明属于多肽合成技术领域，具体涉及一种普卡那肽的制备及纯化方法。

背景技术

普卡那肽是一种鸟苷酸环化酶C（GC-C）受体激动剂，效应与利尿钠肽尿鸟苷素相似，可诱导液体分泌进入胃肠道，从而增加胃肠动力，从而治疗便秘，并获得美国食品和药物监督管理局（FDA）的批准上市。普卡那肽为含有两对二硫键的十六肽，其肽序如下：H-Asn¹-Asp²-Glu³-Cys⁴-Glu⁵-Leu⁶-Cys⁷-Val⁸-Asn⁹-Val¹⁰-Ala¹¹-Cys¹²-Thr¹³-Gly¹⁴-Cys¹⁵-Leu¹⁶-OH，肽链中的二硫键连接方式为Cys4-Cys12，Cys7-Cys15。

普卡那肽制备中，通常由树脂固相载体和Fmoc-Leu-OH偶联得到Fmoc-Leu-树脂，通过固相合成法，按照普卡那肽主链肽顺序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，按照普卡那肽主链肽序依次进行氨基酸的偶联，合成完毕之后进行裂解，在水溶液或者DMSO溶液中进行液相环化，最后纯化，冻干后得到普卡那肽；但是在高氧化能力下，二硫键错配程度高，导致最终纯化困难。

发明内容

本发明的目的在于提供一种收率高、纯化效果好的普卡那肽的制备及纯化方法。

本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

一种普卡那肽的制备方法，包括：

通过半胱氨酸与二苯基乙醛反应后生成半胱氨酸衍生物，然后向半胱氨酸衍生物中引入保护基团得到Fmoc-半胱氨酸衍生物；

将首批氨基酸类试剂活化后，首先将Fmoc-Leu-OH试剂与Wang树脂偶联，然后按普卡那肽的氨基酸顺序依次偶联9种氨基酸类试剂得到十肽树脂；首批氨基酸类试剂中含有Fmoc-半胱氨酸衍生物；

采用初环氧化试剂对十肽树脂处理得到初环十肽树脂；

将初环十肽树脂与次批活化的氨基酸类试剂按普卡那肽的氨基酸顺序依次偶联得到单环普卡那肽-Wang树脂，经切割试剂处理，得到单环普卡那肽；

采用双环氧化试剂对单环普卡那肽处理及纯化得到普卡那肽。普卡那肽制备中存在着二硫键错配问题，本发明通过半胱氨酸与二苯基乙醛反应后制备半胱氨酸衍生物，然后再与Fmoc-OSu反应引入保护基团，然后将Fmoc-(R)Cys-OH与其他氨基酸类试剂分别活化后，通过树脂偶联合成普卡那肽，本方法先合成十肽树脂，并且其中使用Fmoc-(R)Cys-OH，Fmoc-(R)Cys-OH于十肽树脂中首次Fmoc-Cys(Mmt)-OH使用后使用，在十肽树脂中最后一个Fmoc-Cys(Mmt)-OH偶联后，经处理后采用氧化试剂形成二硫键，最后再偶联其余氨基酸类试剂，再氧化制备得到普卡那肽，本发明中Fmoc-(R)Cys-OH的使用，对肽的合成中可以阻止肽链中氢键的缔合，使反应位点暴露出来，提高普卡那肽的收率，并且采用分段氧化，可以避免二硫键的错配，同样有助于普卡那肽收率的提高。