[发明专利]一种同时鉴别三种牛腹泻病病原的引物组合及RT-LAMP检测方法

说明书

本发明公开了一种同时鉴别三种牛腹泻病病原的引物组合及RT‑LAMP检测方法。本发明提供的引物组合由序列表中的SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.24的序列组成，内引物FIP和BIP上各增加一条探针FD和BD，在探针3’端标记荧光基团，内引物5’端标记淬灭基团。筛选三种不同荧光基团标记探针，反应后通过肉眼直接读取反应结果。本发明还保护同时检测牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒和产肠毒大肠杆菌的方法，本方法用水浴锅反应65分钟，结束后直接观察反应管颜色判读结果，可进行多重鉴别检测，不需要电泳和添加染料，方便快速，省时省力。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种同时鉴别三种牛腹泻病病原的引物组合及RT-LAMP检测方法。

背景技术

牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrheal，BVDV)，牛轮状病毒(bovinerotavirus，BRV)和产肠毒大肠杆菌(enterotoxigenic E.coli，ETEC)是引起牛腹泻病的三种主要病原体。BVDV以持续性无症状感染的形式存在于牛体内，引起牛的免疫抑制，常与其它病原体共同混合感染牛，牛群中很大一部份牛是BVDV携带者，孕牛感染BVDV后可生产持续性感染的小牛(PI牛)，PI牛终身带毒持续散毒，引起疾病的流行传播。BRV是引起1月龄犊牛腹泻的主要病原，发病率为60％～80％，死亡率为0％～50％。ETEC能产生肠毒素，导致宿主分泌性腹泻。三种腹泻病的临床症状症状十分相似：精神沉郁，水样腹泻，脱水，发热，消瘦，单凭临床症状很难对患病牛进行准确诊断。因此需建立BVDV，BRV和ETEC的快速检测方法，对牛腹泻病进行快速准确地检测诊断，为牛腹泻合理用药提供技术支持。

申请人曾尝试开发这三种牛腹泻病病原体的检测技术，例如发明专利申请《一种同时鉴别3种牛腹泻病病原体的引物组合及GeXP检测方法》(CN106191310A)，该方法使用GeXP技术进行检测，仍存在诸多缺陷：针对每种病原体设计2条引物，整个反应体系里有6条引物，体系中无探针，在检测时需要使用PCR仪和毛细管电泳分析仪，仪器昂贵，试剂成本高，反应时间长(6小时)，操作繁琐，在基层难以推广，而且检测耗时较长，检测灵敏度也不理想。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种可在恒温条件下扩增目标基因的新型核酸扩增技术，具有方便快速、特异、敏感等优点，仅用一台水浴锅65分钟即可完成反应，但LAMP由于其结果判定方法的局限(浊度、颜色、加染料)，全球多重LAMP领域一直未有较大突破。虽然目前国内外多位学者已建立了多重LAMP检测方法，但这些方法都有一定的不足：只能检测样品是否带病，但不能确定具体是哪一种病原引起的结果，操作繁琐，反应后仍需电泳区分，实验室核酸污染大。申请人曾采用该技术开展了一些前期工作，例如发明专利申请《一种鉴别牛轮状病毒和产肠毒大肠杆菌的引物及方法》(CN107699639A)和《用于鉴别牛病毒腹泻病毒和牛轮状病毒的引物组合及其应用》(CN106987657A)，这两个专利申请都使用LAMP技术进行检测，然而都只能同时检测两种病原，在反应体系中没有探针，是在内引物上添加荧光基团，反应结束后要跑胶才能读取检测结果，耗时长反应时间长(155分钟)、实验室核酸污染大。

综上，目前急需将LAMP技术与探针结合技术应用，建立一种同时鉴别BVDV，BRV和ETEC的多重RT-LAMP检测方法，开展高通量现场病原快速检测技术的研究，为三种牛腹泻病的检测提供技术支撑，可用于牛病流行病学的监测和突发疫情的鉴别诊断，保障养牛业的健康发展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时鉴别牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒和产肠毒大肠杆菌的引物组合，所述引物组合由引物组Ⅰ、引物组Ⅱ和引物组Ⅲ组成；

所述引物组Ⅰ包括引物BVDV-F3、引物BVDV-B3、引物BVDV-FIP、引物BVDV-BIP、引物BVDV-Floop、引物BVDV-Bloop、引物BVDV-FD和引物BVDV-BD；