[发明专利]用于CYP3A5多态性位点基因分型检测的试剂盒及其检测方法

说明书

本发明提供了用于CYP3A5多态性位点基因分型检测的试剂盒及其检测方法，包括：野生型检测序列1、野生型检测序列2、突变型检测序列1与突变型检测序列2。本发明将引物结合序列和探针结合序列整合到一起，猝灭效果不是很理想，所以在序列的设计过程中引入了双猝灭基团，提高反应灵敏度，降低本底信噪；为了提高杂交的特异性，在原有MGB探针的基础上，在引物后半部区域引入rna碱基，用于区别SNP分型检测位点，在RNA修饰的碱基的上游引入突变设计，是为了进一步提高反应的特异性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及用于CYP3A5多态性位点基因分型检测的试剂盒及其检测方法。

背景技术

对于CYP3A5*3基因多态性检测的方法有很多种，如限制性长度多态性分析(RFLP)、直接测序法、印记杂交法、Taqman技术、等位基因特异性扩增法(ARMS)等。其中，最常用的测序法能够直接检测突变位点的位置和类型，但该方法操作步骤繁琐，检测周期长，灵敏度低，且扩增产物容易产生污染。

例如探针水解法，在PCR反应系统中加入2种不同荧光标记的探针，它们可分别与2个等位基因完全配对。正常情况下，由于探针5′端荧光基团和3′端淬灭基团紧邻在一起，荧光被淬灭。随着PCR的有效进行，与模板完全配对的探针逐步被Taq DNA聚合酶5′→3′外切酶活性切割，致使探针5′端上的荧光基团与3′端的淬灭基团分离，淬灭效应解除，报告荧光基团被激活；而与模板不能完全配对的探针(代表另一种等位基因)不能被有效切割，故检测不到荧光信号，通过相应仪器检测荧光值的变化即可实现SNP位点检测。目前常用的探针修饰技术主要是MGB探针、LNA探针和PNA探针，它们均在一定成都上能提高反应特异性，但仍然在反应扩增末期容易出现非特异性荧光信号。

又例如ARMS-PCR法，扩增阻滞突变系统PCR(Amplification RefractoryMutation System PCR，ARMS-PCR)，又称为等位基因特异性PCR(Allele-Specific PCR，AS-PCR)。ARMS-PCR技术建立在等位基因特异性延伸反应基础上，只有当某个等位基因特异性引物的3’末端碱基与突变位点处碱基互补时，才能进行延伸反应。常规PCR扩增DNA所用的上、下游引物与靶序列完全匹配，而等位基因PCR采用等位基因特异的两条上游引物，两者在3’端核苷酸不同，一个对野生型等位基因特异，另一个对突变型等位基因特异，在TaqDNA聚合酶作用下，与模板不完全匹配的上游引物将不能退火，不能生成PCR产物，而与模板匹配的引物体系则可扩增出产物，通过凝胶电泳或者qPCR就能很容易地分辨出扩增产物的有无，从而确定SNP基因型，目前市场主流为ARMS+qPCR技术，采用TaqMan探针进行检测。(比如肿瘤靶向用药EGFR基因检测，CFDA批准的检测试剂盒，90％以上都是ARMS检测方法)简而言之：引物3’端错配的碱基会导致PCR引物延伸速度变慢，当错配达到一定程度时，引物延伸将终止，得不到特异长度的PCR扩增产物，从而提示模板DNA没有与引物3’端配对的碱基，反之则有。

上述方法对引物设计区域序列和反应酶有严格的限制要求，且容易产生非特异性扩增。

发明内容

本发明的目的在于为了解决探针水解法或ARMS-PCR法，对引物设计区域序列和反应酶有严格的限制要求，且容易产生非特异性扩增的缺陷，而提供一种用于CYP3A5多态性位点基因分型检测的试剂盒及其检测方法，能够提高检测结果的准确度，提高反应的特异性。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

用于CYP3A5多态性位点基因分型检测的试剂盒，包括：野生型检测序列1、野生型检测序列2、突变型检测序列1与突变型检测序列2；

所述野生型检测序列1、所述野生型检测序列2中从5'端依次包括引物通用序列区域、引物序列与野生型探针序列的共用区域，rna碱基、第一淬灭基团与3'端；所述突变型检测序列1与所述突变型检测序列2中，从5'端依次包括引物通用序列区域、引物序列与突变型探针序列的共用区域，rna碱基、第一淬灭基团与3'端；