[发明专利]一种检测结核分支杆菌耐药基因的核酸组合物、试剂盒及检测结核分支杆菌耐药性的方法

说明书

本发明公开了一种检测结核分支杆菌耐药基因的核酸组合物、试剂盒及检测结核分支杆菌耐药性的方法，涉及医学检测技术领域。本发明结合单碱基延伸反应技术，通过确定katG315、rpoB435和embB306基因的待测突变位点，设计出扩增引物和各突变位点的延伸引物，经过PCR扩增、消化处理、延伸反应后使用树脂纯化，纳升点样制备样本并上质谱检测，最终经过比对确定位点突变明细，从而判定结核分支杆菌的对异烟肼、利福平和乙胺丁醇的耐药性。检测结果可广泛应用于临床检验、疾病预防、流行病筛查、进出口检验检疫等领域。

技术领域

本发明涉及医学检测技术领域，具体而言，涉及一种检测结核分支杆菌耐药基因的核酸组合物、试剂盒及检测结核分支杆菌耐药性的方法。

背景技术

截至2020年，由结核分支杆菌引起的结核病依然是危害人类生命健康的主要传染病之一，而结核菌的多重耐药性是现代结核病治疗过程中面临的最大困难和严峻挑战。近10年来，结核分支杆菌对包括异烟肼(INH)、利福平(RIF)和乙胺丁醇(EMB)等临床主流的抗结核杆菌药物耐药性已明显上升。已阐明的部分结核分枝杆菌耐药机制中，认为耐利福平是作用于靶向分子RNA聚合酶亚基β亚基的编码基因(rpoB)的决定位点突变所致；耐异烟肼(INH)与过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因(katG)或烯酰基还原酶编码基因(inhA)操纵子改变有关；耐乙胺丁醇(EMB)与阿拉伯糖基转移酶的编码基因(embABC)操纵子突变有关。

因此，应用各种基因突变检测技术分析这些耐药基因突变位点，即可检出耐药的结核分枝杆菌。目前检测目标位点基因突变的方法有很多种，如荧光定量PCR、全基因测序、基因芯片等。但荧光定量PCR受限于荧光种类和试剂耗材，通量小、成本高；全基因测序则需要专业的技术基础，操作复杂、耗时费力；基因芯片虽然利用靶核苷酸微点阵探针可以检测新突变，但灵敏度较低、重复性差。因此，急需开发一种操作简单、准确性高、通量大、经济可靠的检测方法，以满足临床诊断中快速、准确鉴定需求。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测结核分支杆菌耐药基因的核酸组合物、试剂盒及检测结核分支杆菌耐药性的方法以解决上述技术问题。

本发明基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)，结合单碱基延伸反应技术，通过确定katG315、rpoB435和embB306基因的待测突变位点，设计出扩增引物和各突变位点的延伸引物，经过PCR扩增、消化处理、延伸反应后使用树脂纯化，纳升点样制备样本并上质谱检测，最终经过比对确定位点突变明细，从而判定结核分支杆菌的对异烟肼、利福平和乙胺丁醇的耐药性。检测结果可广泛应用于临床检验、疾病预防、流行病筛查、进出口检验检疫等领域。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种检测结核分支杆菌耐药基因的核酸组合物，其包括PCR扩增引物组，PCR扩增引物组包括第一引物组、第二引物组、第三引物组、第四引物组、第五引物组和第六引物组中的至少一组引物组；

第一引物组如SEQ ID NO.1-2所示，第二引物组如SEQ ID NO.3-4所示，第三引物组如SEQ ID NO.5-6所示，第四引物组如SEQ ID NO.7-8所示，第五引物组如SEQ ID NO.9-10所示，第六引物组如SEQ ID NO.17-18所示。

上述第一引物组用于扩增检测过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因(katG)315位点的突变，第二引物组用于扩增检测RNA聚合酶亚基β亚基的编码基因(rpoB)435位点的突变，第三引物组用于扩增检测RNA聚合酶亚基β亚基的编码基因(rpoB)445位点的突变，第四引物组用于扩增检测RNA聚合酶亚基β亚基的编码基因(rpoB)450位点的突变，第五引物组用于扩增检测阿拉伯糖基转移酶的编码基因(embABC)306位点密码子第一位的突变，第六引物组用于扩增检测阿拉伯糖基转移酶的编码基因(embABC)306位点密码子第三位的突变。