[发明专利]检测SMAD4基因全外显子突变的引物、方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测SMAD4基因全外显子突变的引物、方法及试剂盒，所述特异性引物包括扩增覆盖SMAD4基因全部12个外显子的正反向引物；本发明采用Sanger测序法检测SMAD4基因全外显子突变，可快速检测SMAD4基因全外显子的突变。利用本发明完成的检测结果准确，可以专一性鉴别SMAD4基因是否突变，确保了测定结果的准确性和唯一性；可辅助疾病诊断，提高疾病的风险评估，对早期干预、早期治疗有重要的参考意义。

技术领域

本发明属基因检测技术领域，具体涉及检测SMAD4基因全外显子突变的引物、方法以及试剂盒。

背景技术

SMAD4基因是一种新型抑癌基因，最初由Hahn等在胰腺癌中发现，亦被称为胰腺癌缺失基因4(Deleted in Pancreatic Cancer-4,DPC4)，位于人类染色体18q21.1，该基因序列包含12个外显子，转录子长2680bp，编码的蛋白SMAD4由552个氨基酸残基组成。SMAD4编码的蛋白属于SMAD家族，可以被跨膜丝氨酸：苏氨酸受体激酶激活，是一种信号转导蛋白。大多数研究认为，SMAD4在TGF-β信号传导途径中作为关键性中间传导分子，所有生物学效应均是受体调节蛋白SMAD4与其他SMAD蛋白(包括R—SMAD、Atagonistic SMAD)相互作用的结果，在参与细胞的增殖、分化、凋亡过程以及组织的生长发育、再生、修复中起到重要作用。

正是因为SMAD4在信号传导通路中的中心作用，故SMAD4基因的突变、丢失和表达下调均会导致信号传导通路异常，最终导致一些肿瘤的发生。SMAD4的常见的变异类型主要有：1.染色体片段的缺失；2.基因突变；3.基因表达水平异常。研究表明SMAD4基因在多种癌症中存在缺失或低表达，与常见癌症例如大肠癌、胰腺癌等的发生发展密切相关，是一个不容忽视的基因突变。有研究表明SMAD4基因在大肠癌早期很少发生突变但是SMAD4表达与组织分化程度、肿瘤大小浸、润深度、淋巴转移和临床分期有关。大肠癌是结直肠正常黏膜上皮在各种致癌因素作用下发生的恶性肿瘤，是消化道较为常见的恶性肿瘤，具有高复发、高转移的特点，预后不良是消化道癌症导致死亡的主要原因之一，其发病率和死亡率极高，现今治疗手段以手术切除为主且发病机制仍尚未明确。另外，大约50％的胰腺癌患者伴有SMAD4基因的缺失或变异，与胰腺癌的发生、侵袭、转移预后关系极其密切。胰腺癌发生早期并无明显症状，确诊时多属晚期，故关于SMAD4抑癌基因的研究对胰腺癌诊断、治疗具有潜在的应用价值。

虽然SMAD4在诸多水平、复杂而协调的具体调控机制及其调控失衡与肿瘤之间的关系还未见报道，但近几年关于SMAD4基因突变在消化道疾病转移和预后的评估及预测越来越多，通过对患者SMAD4基因的检测可以辅助诊断疾病，对一些癌症进行预防，降低癌症的发生风险，也能更合理有效的选择治疗方案，因此对SMAD4基因进行全外显子测序具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供SMAD4基因全外显子序列测序相关引物的核酸序列，包括覆盖SMAD4基因全部12个外显子突变位点的正、反向引物，以及一对测序引物M13F和M13R，其碱基序列为：

SMAD4-1F：CAGGTGTGTCGTAGGATTCG

SMAD4-1R：GGGAGAAGGTGGCTAGGTTG

SMAD4-2F：TTTCCTTGCAACGTTAGCTG

SMAD4-2R：GGAGCACAAATTAAATTACCCTG

SMAD4-3F：CTGAGTTGGTAGGATTGTGAGG

SMAD4-3R：TGAAACACTATTGAGATCCTTTTCC

SMAD4-4F：GCGTTTATGCTACTTCTGAATTG

SMAD4-4R：TTAATGTTACTGCCTGCCGC