[发明专利]一种结直肠癌PDX模型构建的方法

权利要求书

1.一种结直肠癌PDX模型构建的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：采集人结直肠癌样本，并进行运输和保存；

S2：培养人结直肠癌原代细胞，并进行传代培养；

S3：细胞换液和传代冻存，并在人结直肠癌原代细胞进行冻存时对细胞进行计数；

S4：细胞鉴定：培养人结直肠癌原代细胞，并对培养的细胞进行免疫荧光鉴定与HE染色鉴定；

S5：细胞接种：将培养得到的人结直肠癌原代细胞按1×10⁷个/ml接种至BALB/c-nude裸鼠；

S6：瘤体观察和检测指标：观察人直肠癌PDX模型构建情况，测量瘤体大小并计算肿瘤体积，对肿瘤组织进行取材和固定后，进行形态学指标检测；

在步骤S2中，所述培养人结直肠癌原代细胞，并进行传代培养的具体步骤为：

S2.1：采用紫外光对超净台提前照射，并将完全培养基和清洗液进行预冷；

S2.2：在超净工作台上将癌组织取出，置于无菌培养皿中，剃除组织筋膜；再用4℃预冷的清洗液II冲洗组织3 次；用眼科剪把冲洗好的组织修剪成约1mm³大小，将组织块接种到培养皿上，在每一个组织块周围加上适量胎牛血清FBS，缓慢浸没组织块后放入培养箱，倒置培养12h左右，再加入适量完全培养基I正置培养；清洗液II的配制：Hanks溶液+1%的青霉素/链霉素（P/S）+1%庆大霉素+1%两性霉素+1%甲硝唑；完全培养基I：20%FBS+1640基础培养基+1%的青霉素/链霉素（P/S）；

S2.3：观察细胞，并记录细胞生长，7-10天后细胞大量爬出后，当组织块周围爬出细胞密度到达90-100%时进行梯度消化处理、离心处理以及传代培养处理；

S2.4：梯度消化：步骤1，吸出培养皿中的培养基，采用2-3ml PBS将培养皿清洗三次；吸干PBS，并向培养瓶中加入1 ml 0.25%胰蛋白酶置于37℃培养箱进行细胞消化3min；当细胞出现皱缩，变圆时，向培养瓶中加入1ml带血清培养基终止反应，将细胞悬液转移至15ml离心管中；步骤2，重复步骤1一次；步骤3，再重复步骤1一次；采用离心机对离心管中三次细胞消化得到的细胞悬液分别进行离心操作；

S2.5：弃去离心管中的上清，分别加入1ml完全培养基II进行细胞重悬，将重悬的细胞液接种到T25中进行传代培养；完全培养基II的配制：10% FBS+1640基础培养基+1%的青霉素/链霉素（P/S）；

在步骤S5中，将人结直肠癌原代细胞接种裸鼠的具体步骤为：

S5.1：准备BALB/c-nude裸鼠18-22g；

S5.2：细胞消化：吸出培养瓶中的培养基，采用2-3mLPBS将培养瓶清洗3次，吸干PBS，并向培养瓶中加入1mL 0.25%胰蛋白酶置于培养箱进行细胞消化；在倒置显微镜下观察细胞的形态；

S5.3：细胞计数：弃去离心管中的上清液，加入1mL DMEM基础培养基进行细胞重悬；采用移液枪吸取10µL细胞悬液于血球计数板中，并将血球计数板置于倒置显微镜下，对细胞进行计数；

S5.4：原代细胞接种：人结直肠癌原代细胞接种前将细胞密度调整为1x10⁷个/mL；用异氟烷麻醉BALB/c-nude裸鼠后，消毒裸鼠腋窝下的皮肤，将人结直肠癌原代细胞接种到裸鼠腋窝，皮下注射200µL/只，待裸鼠苏醒后放回笼中饲养观察；

在步骤S6中，所述进行人结直肠癌PDX模型构建观察和指标检测的具体步骤为：

S6.1：肿块大小检测；

S6.2：对肿瘤组织进行取材固定后，进行HE和CEA鉴定；

S6.3：组织包埋：S6.3.1，肿瘤组织标本经多聚甲醛固定，流水冲洗；S6.3.2，脱水依次用70%酒精、80%酒精、90%酒精、95%酒精、100%酒精、100%酒精；S6.3.3，采用二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ进行透明处理；S6.3.4，将组织块放入软蜡浸；S6.3.5，组织包埋好后常温冷却并放置在冷台上；

S6.4：切片制作：S6.4.1，将已固定和修好的石蜡块装在切片机的夹物台上，调整石蜡块与刀口之间的角度与位置和切片厚度，开始切片；S6.4.2，铺片时用眼科镊子镊起蜡带平铺在水面上并展平；S6.4.3，蜡片在水面展平后，将蜡片捞到载玻片的中段处倾去载玻片的余水进行贴片，置入恒温箱内烤片，脱去溶化组织间隙的石蜡；

S6.5：HE染色：S6.5.1，石蜡切片经过二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ脱蜡单独处理；S6.5.2，将切片置于浓度梯度为100%、95%、90%、80%、70%的酒精溶液中，再放入蒸馏水中进行水化；S6.5.3，切片放入苏木精中染色，用自来水流水冲洗，使切片颜色变蓝；S6.5.4，将切片放入1%盐酸乙醇液中褪色；S6.5.5，切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色；S6.5.6，95％酒精、伊红染色、85%酒精、95%酒精进行脱水和复染；S6.5.7，切片放入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中单独进行透明处理；S6.5.8，采用封片剂进行封片；S6.5.9，光学显微镜下观察组织的形态学改变；

S6.6：CEA免疫组织化学染色：S6.6.1，石蜡切片经过二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ脱蜡；S6.6.2，将切片置于浓度梯度为100%、95%、90%、80%、70%的酒精溶液中，蒸馏水中进行水化；S6.6.3，将切片置于盛有浓度为0.01moL/L且pH为6.0的柠檬酸钠缓冲液的高压蒸汽锅中，加热进行抗原修复，室温冷却；S6.6.4，用3%过氧化氢室温孵育，PBS冲洗，向玻片上滴加封闭剂5%-10%的山羊血清封闭，低温培养箱中孵育并倾去血清；S6.6.5，用吸水纸擦干载玻片上组织周围的山羊血清后，放入湿盒内并在圈定组织上按要求滴加一抗，放入烤箱，PBS冲洗；S6.6.6，除去PBS，每张切片滴加二抗，室温孵育20min，PBS冲洗；S6.6.7，除去PBS，每张切片滴加50µL新配制的DAB溶液，显微镜下观察；S6.6.8，将切片浸泡于苏木精中进行复染，自来水冲洗返蓝；S6.6.9，将复染的片子用自来水冲洗，再置于盐酸乙醇中返蓝，先后经浓度梯度酒精和二甲苯脱水；S6.6.10，中性树胶封好后置于通风柜中晾干。