[发明专利]一种检测烟草转基因成分的引物组合、试剂盒、检测方法及应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测烟草转基因成分的引物组合、试剂盒、检测方法及应用。所述的检测烟草转基因成分的引物对组合包括用以扩增15种常用的检测转基因元件以及1种烟草内参基因序列NT_UBI的引物对。本发明还涉及检测烟草转基因成分的试剂盒及检测方法。本发明技术方案操作简单，检测效率高；检验对象全面，具有较高的检测特异性、准确度和灵敏性等特点；可用于转基因烟草及其制品的大规模检测，具有较好的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种检测烟草转基因成分的引物组合、试剂盒、 检测方法及应用。

背景技术

烟草(Nicotiana tabacum L.)属于茄科，烟草属。起源于大洋洲、美洲以及南太平洋的一些岛屿。烟草是一种重要的经济作物，也是世界各国的第一锐利行业，种植面积非常大。如何改善烟草的品质和产量以及抗逆性是研究者关心的问题。由于烟草易于组织培养和转化，通过转基因技术得到烟草植株及其后代可以改善上述问题。但是转基因制品的安全问题一直是人们重视的问题。因此，开发高效、便捷的转基因检测技术显得至关重要。

转基因产品的检测技术主要包括基于蛋白的检测方法和基于核酸的检测方法。目前基 于核酸的PCR检测方法仍是目前最普遍、最准确的转基因检测技术，其主要包括普通定性 PCR、巢式PCR、环介导等温扩增技术(LAMP)、荧光定量PCR多重PCR等方法。相对于普通定性PCR方法，巢式PCR高了检测的灵敏度，容易造成假阳性。LAMP操作简单、特异性强， 然而引物设计较为复杂，容易造成DNA污染，影响后续的实验。荧光定量PCR方法具有重 复性好、灵敏度高、核酸交叉污染少的优点，但其成本高，并且需要特殊检测仪器。普通 的多重PCR方法可以在一个反应中同时检测多个基因，但一般不超过六重，否则引物之间 干扰较大，影响检测效果。基因芯片和数字PCR技术也是常用的转基因产品检测技术，它 们均具有高通量、灵敏度高、特异性强等优点，且可平行检测1个转基因作物中多个基因 或同时检测多种转基因作物；然而其成本高昂，需要专门的仪器设备，要求操作人员具有 较高的专业素质，这些因素限制了该技术在检测中的广泛应用。

因此研发一种高效、灵敏和通量高的转基因产品检测方法，成为亟待解决的关键问题。

发明内容

本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：

筛选常用的烟草转基因产品检测元件核苷酸序列即靶标分子及内参基因作为检测目 标。包括15种检测常用的转基因元件：p35S、t35S、pFMV35S、tNOS、PAT、bar、NPtII、Hpt、cp4epsps、E93、TMV-CP、pVY_CP、CMV_CP、Cry1Ab和GUS以及包括1烟草内参基因 的序列NT_UBI。

接着，本发明开发了用于检测所述的转基因元件和烟草内参基因的多重PCR引物组合 物，其中15对针对15种转基因元件，1对针对1个内参基因。所述引物互相间不冲突，可以通过多重PCR进行高效的扩增。所述多重PCR引物组合物可以用于开发转基因元件检测试剂盒。

具体的技术方案为，第一方面，本申请提供了一种检测烟草转基因成分引物对组合， 所述的引物对组合包括编号为NtGMO1、NtGMO2、NtGMO3、NtGMO4、NtGMO5、NtGMO6、NtGMO7、 NtGMO8、NtGMO9、NtGMO10、NtGMO11、NtGMO12、NtGMO13、NtGMO14、NtGMO15的15对引物，每对引物由正向引物和反向引物组成，具体的引物对组合核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.30所示。

还提供了包括用于扩增烟草内参基因NT_UBI的编号为NtGMO16的一对引物对组合，其 核苷酸序列如SEQ ID NO.31-SEQ ID NO.32所示。