[发明专利]产生转录核酸的方法和工具

权利要求书

1.一种产生转录核酸的方法，包括以下步骤

a)提供核酸模板，

b)将寡核苷酸探针与该核酸模板杂交，其中所述寡核苷酸探针包含与核酸模板杂交的互补部分，和位于互补部分的5'方向、不与核酸模板杂交、且包含转录启动子序列的非互补部分，

c)水解核酸模板的3'部分，所述3'部分位于该核酸模板在步骤b)中与寡核苷酸探针杂交的部分的3'方向，且所述3'部分不与寡核苷酸探针杂交或与寡核苷酸探针杂交，

d)用与寡核苷酸探针的非互补部分互补的核酸延伸该核酸模板，由此生成与核酸模板顺次排列的转录启动子序列的双链体，

e)用结合转录启动子序列双链体的转录酶转录该核酸模板，由此产生转录的核酸。

2.权利要求1的方法，其中核酸模板包含RNA或由RNA组成。

3.权利要求1或2的方法，其中水解是用外切核酸酶进行，优选催化3'→5'方向去除核苷酸的单链RNA特异性外切核酸酶。

4.权利要求1或2的方法，其中水解包括水解模板中与寡核苷酸探针杂交的区域中的糖磷酸主链，优选磷酸二酯键，从而在模板中引入切口，优选地，其中水解是通过内切核酸酶来进行。

5.权利要求1至4中任一项的方法，其中延伸所述核酸模板是通过核苷酸聚合来进行，优选使用DNA聚合酶。

6.权利要求1至5中任一项的方法，还包括在与核酸模板杂交时从互补部分延伸寡核苷酸探针的步骤，优选地，其中所述延伸是在步骤b)和c)之间，在步骤c)和d)之间，或在步骤d)和e)之间。

7.权利要求1至6中任一项的方法，其中寡核苷酸探针的非互补部分在互补部分和转录启动子序列之间包含标识符序列和/或第一衔接子序列。

8.权利要求1至7中任一项的方法，进一步包括可选地将一或多个二级引物与所述一或多个转录核酸的第二衔接子序列杂交，并以模板依赖的方式延伸所述二级引物。

9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述核酸模板是来自细胞器、细胞切片、或细胞的RNA，优选来自1至1000个细胞、细胞器或细胞切片。

10.权利要求1至9中任一项的方法，其中所述核酸模板位于包含DNA的核酸库中，优选与权利要求3或4组合，其中所述DNA不能被权利要求3的外切核酸酶或能水解权利要求4的磷酸二酯键的酶(优选内切核酸酶)消化，并由此排除在任何后续转录之外。

11.权利要求1至10中任一项的方法，包括在容器中提供核酸模板，并在所述容器中进行步骤b)至e)。

12.权利要求1至11中任一项的方法，包括提供一种或多种细胞，裂解所述细胞的细胞材料，将酶灭活，优选通过蛋白酶灭活，由此证明所述细胞的核酸是根据步骤a)的核酸模板。

13.适用于权利要求1至12中任一项的方法的多个寡核苷酸探针的集合，其中每一寡核苷酸探针包含与所选模板序列互补的序列，优选包含至少6个连续T的聚(T)-序列、转录启动子序列和长度至少为4个核苷酸的标识符序列，其中优选转录启动子序列对于多个寡核苷酸探针是相同的和/或优选标识符序列对于多个寡核苷酸探针中的至少两个是不同的；和/或优选地，其中转录启动子序列是单链的。

14.适用于实施权利要求1至12中任一项的方法的试剂盒，包括含转录启动子序列的寡核苷酸探针、3'→5'外切核酸酶或内切核酸酶、DNA或RNA聚合酶、以及能在转录启动子序列处启动转录的转录酶。

15.权利要求14的试剂盒，其进一步包含dNTP、细胞裂解试剂、蛋白酶、逆转录酶、或其任何组合。