[发明专利]核酸扩增方法

说明书

本发明提供一种高灵敏度且高产量的利用RNA的核酸扩增方法。该核酸扩增方法包括通过逆转录反应由样本RNA合成cDNA的步骤和利用多重PCR扩增该cDNA的步骤，该逆转录和该多重PCR在单链核酸结合蛋白的存在下进行，该单链核酸结合蛋白为T4GP32或其变异体。

技术领域

本发明涉及一种核酸扩增方法。

背景技术

多重PCR是通过同时使用多个引物对的PCR反应而从1个DNA样本同时扩增多个区域的方法。将从RNA向cDNA的逆转录(RT)反应与多重PCR组合而成的多重RT－PCR已被利用于基因表达分析和基因分型等。

RNA通常从组织样本中提取。另外，作为更简便且非侵入的RNA提取方法，最近公开了从皮肤表面脂质(skin surface lipids；SSL)中提取RNA的方法(专利文献1)。SSL所含的RNA作为用于基因表达分析等的RNA样本是有用的。然而，能够从1个被检测体中回收的SSL的量不多，并且其中所含的RNA的量也不多，因此利用1个被检测体的SSL能够制备的RNA的量是微量的。

在非专利文献1中记载了BSA和T4 gene 32protein(T4GP32)改善了在抑制物质存在下的PCR反应。在非专利文献2中记载了DMSO和甜菜碱提高了PCR的特异性和产量。在非专利文献3、4中记载了在RT－PCR时，通过向RT体系添加T4GP32，RT－PCR产物的产量显著增加了，但即使向RT后的PCR体系添加T4GP32，也观察不到明显的产量增加。在专利文献2中记载了在以RNA为模板扩增cDNA的扩增逆转录法(RT－RamDA法)中，通过使T4GP32与从模板RNA剥离的单链cDNA结合，保护该cDNA不被核酸酶分解，从而增加cDNA的产量。

(专利文献1)国际公开公报第2018/008319号

(专利文献2)国际公开公报第2016/052619号

(非专利文献1)Appl Environ Microbiol,1996,62(3):1102－1106

(非专利文献2)PLOS ONE,2010,5(6):e11024

(非专利文献3)Appl Environ Microbiol,1998,64(2):669－677

(非专利文献4)BioTechniques,2001,31(1):81－86

发明内容

本发明提供一种核酸扩增方法，其包括：通过逆转录由样本RNA合成cDNA的步骤；和利用多重PCR扩增该cDNA的步骤，该逆转录和该多重PCR在单链核酸结合蛋白的存在下进行，该单链核酸结合蛋白为T4GP32或其变异体。

本发明还提供一种改善剂，其是以单链核酸结合蛋白为有效成分的多重RT－PCR的产量改善剂，该单链核酸结合蛋白为T4GP32或其变异体，并且添加在逆转录和多重PCR双方的反应液中。

具体实施方式

关于本说明书中所引用的全部专利文献、非专利文献和其他出版物，其全部在本说明书中作为参考而被引用。

在本说明书中，关于氨基酸序列或核苷酸序列的“至少90％的同一性”是指90％以上、优选95％以上、更优选97％以上、进一步优选98％以上、进一步优选99％以上的同一性。

在本说明书中，核苷酸序列和氨基酸序列的同一性可以利用Lipman－Pearson法(Science，1985，227：1435－41)进行计算。具体而言，可以利用遗传信息处理软件Genetyx－Win(Ver.5.1.1；软件开发)的同源性分析(Search homology)程序，将Unit sizeto compare(ktup)设为2进行分析而算出。