[发明专利]一种白蜡多年菌胞外多糖和胞内多糖制备方法及其在调节肠道微生物菌群与降血糖应用

权利要求书

1.一种白蜡多年菌胞外多糖和胞内多糖的制备方法，其特征在于包含如下步骤：

（1）将白蜡多年菌菌种接种于液体培养基中进行发酵培养，固液分离，得到白蜡多年菌发酵液和菌丝体，将白蜡多年菌发酵液浓缩备用；

（2）将步骤（1）中得到的白蜡多年菌菌丝体烘干、粉碎过筛，得到菌丝体粉末；然后加入石油醚进行脱脂处理，烘干，得到白蜡多年菌菌丝体干粉；

（3）将步骤（2）中得到的白蜡多年菌菌丝体干粉加入到水中，进行热水浸提，得到白蜡多年菌浸提液；然后将其浓缩，得到白蜡多年菌浸提浓缩液；

（4）将步骤（1）中得到的白蜡多年菌发酵液浓缩后和（3）中得到的白蜡多年菌浸提浓缩液分别采用胰蛋白酶结合Sevage法除蛋白，依次得到除蛋白后的胞外多糖提取液和胞内粗多糖提取液；

（5）将步骤（4）中得到胞外粗多糖提取液和胞内粗多糖提取液分别加入到乙醇溶液中，静置，离心收集沉淀，再分别加水复溶，得到胞外粗多糖溶液和胞内粗多糖溶液；再进行透析、浓缩、冷冻干燥，得到白蜡多年菌胞外粗多糖提取物和胞内粗多糖提取物；

（6）将步骤（5）中得到的白蜡多年菌胞外粗多糖提取物和胞内粗多糖提取物分别进行层析纯化，然后透析，冷冻干燥，得到白蜡多年菌胞外多糖和胞内多糖；

步骤（5）中所述的透析为采用截留分子量为6000~8000 Da的透析袋进行透析；

步骤（6）中所述的透析为采用截留分子量为6000~8000 Da的透析袋进行透析

步骤（6）中所述的层析纯化为通过如下步骤实现：

S1、装柱：往层析柱中加入水，打开下端出液口，再将DEAE-Sepharose Fast Flow填料倒入层析柱中，使之在层析柱中自然沉降；

S2、平衡：利用恒流泵将NaCl缓冲液泵入到层析柱内，打开下端出液口，直至流出液的pH值与NaCl缓冲液的pH值相同；

S3、上样和洗脱：

S31、取胞外粗多糖和胞内粗多糖水溶液，离心后取上清，利用恒流泵缓缓加入已平衡的层析柱中；先用缓冲液洗去未吸附的物质，再分别以NaCl溶液梯度洗脱，设定部分收集器的收集时间，进行收集，并测定总糖含量，合并单一吸收峰样品并浓缩、透析后，对透析液进行浓缩和真空冷冻干燥处理，得到纯化多糖EPPF和IPPF。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（4）中所述的采用胰蛋白酶和Sevage法除蛋白通过如下步骤实现：

（I）将步骤（3）中得到的白蜡多年菌浸提浓缩液和步骤（1）中得到的白蜡多年菌发酵浓缩液分别调pH至8.0，然后分别加入胰蛋白酶溶液，充分振荡后再水浴灭酶，冷却至室温，得到酶解后的白蜡多年菌发酵液和胞内浸提液；

（II）将步骤（I）中得到的酶解后的白蜡多年菌发酵液和胞内浸提液加入氯仿和正丁醇的混合液，剧烈振荡30～40min，然后离心，弃去蛋白层及有机溶液，收集上清液，即为胞内粗多糖提取液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（I）中所述的胰蛋白酶溶液的浓度为质量体积比2%~5%；步骤（I）中所述的胰蛋白酶溶液与浓缩后的白蜡多年菌发酵液和浸提液的体积比均为1：15~30；步骤（II）中所述的氯仿正丁醇混合液中氯仿和正丁醇的体积比为3~7:1；步骤（II）中所述的氯仿正丁醇混合液与酶解后的白蜡多年菌发酵液和胞内浸提液的体积比均为1：0.1~0.25。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）中所述的乙醇溶液与除蛋白后的白蜡多年菌发酵浓缩液和浸提液的体积比为2~5：1；步骤（5）中所述的静置的条件为：0~4℃静置24 ~48h；步骤（5）所述的离心的条件为：5000~10000 rpm离心5 ~15min；步骤（5）中所述的浓缩为浓缩至白蜡多年菌胞外多糖提取液和胞内多糖提取液体积的1/5~1/2。