[发明专利]一种引入标签序列的方法

说明书

本发明属于分子生物技术领域，公开了一种引入标签序列的方法。本发明通过乳液PCR将不同的UMI标签序列配置在不同的乳液液滴中，并保证每个乳液液滴中有一个DNA分子做模板，使每次特异性扩增过程中，向同一模板的扩增产物引入的是同一种UMI标签序列，且通过第二次扩增把样本标签序列Index引入到扩增产物中，使最终的扩增产物同时带有UMI标签序列和样本标签序列Index，避免出现多个扩增产物对应大量UMI标签序列的情况，解决了相关技术中在测序时的数据浪费问题。

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种引入标签序列的方法。

背景技术

下一代测序(NGS)可以同时对数百万个DNA片段进行测序，在分析测序结果时，常需要区分多个目的片段是否来源于同一模板，常用的扩增法需要在目的片段上引入用于区分文库的样本标签序列Index外，还需引入用于区分模板的UMI标签序列。

在具体操作时需要进行两轮扩增，首先在第一轮特异性扩增中引入UMI标签序列，然后在第二轮通用引物扩增中引入样本标签序列Index，从而完成对样本标签的引入，以区分来自不同样本的片段。但上述方法存在一定的缺陷：由于第一轮扩增的目的是特异性扩增，扩增循环数不能太少(一般为15轮左右)，但是每轮特异性扩增都会在扩增产物中随机引入UMI标签序列，如果扩增效率为2，扩增15个循环就会出现来源于同一模板的扩增产物与约2¹⁵个UMI标签序列对应的情况，使得在后续的聚类分析中，同一种扩增产物对应大量聚类，造成数据的大量浪费。因此，有必要提供一种每次特异性扩增向同一模板的扩增产物中引入同一种UMI标签序列的方法，以减少数据的浪费。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种引入标签序列的方法，能够保证在每次特异性扩增过程中，向同一模板的扩增产物引入的是同一种UMI标签序列。

在说明书中提到的核酸序列都为5’-3’的方向。

根据本发明的一个方面，提出了一种引入标签序列的方法，包括以下步骤：

S1：提供第一油相和第一水相，所述第一水相为制备包括UMI标签序列的核酸片段的反应体系，混合所述第一油相和所述第一水相形成第一乳液液滴，将所述包括UMI标签序列的核酸片段配置于不同的所述第一乳液液滴中，使每个所述第一乳液液滴中配置的所述核酸片段包括不同的所述UMI标签序列；

S2：提供样本和第一引物对，将所述样本中的每个DNA分子、所述第一引物对和所述包括UMI标签序列的核酸片段配置于不同的第二乳液液滴中，通过乳液PCR进行特异性扩增，得第一扩增产物，使位于一个所述第二乳液液滴中的所述第一扩增产物携带有相同的所述UMI标签序列；

S3：提供包括样本标签序列Index的第二引物对，以步骤S2所述第一扩增产物为模板进行扩增，得第二扩增产物，使所述第二扩增产物携带所述样本标签序列Index和所述UMI标签序列。

根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：

本发明通过乳液PCR将不同的UMI标签序列配置在不同的乳液液滴中，并保证每个乳液液滴中有一个DNA分子做模板，使每次特异性扩增过程中，向同一模板的扩增产物引入的是同一种UMI标签序列，且通过第二次扩增把样本标签序列Index引入到扩增产物中，使最终的扩增产物同时带有UMI标签序列和样本标签序列Index，避免出现多个扩增产物对应大量UMI标签序列的情况，解决了相关技术中在测序时的数据浪费问题。

在本发明的一些实施方式中，所述第一乳液液滴是油包水乳液液滴，按第一油相和第一水相的体积比为(3～3.5)：1配制而成。