[发明专利]一种鸭冷冻精液的制备方法

说明书

本发明公开了一种简单的鸭冷冻精液制作方法，包括鸭精子稀释液、鸭精子冷冻保护液以及冷冻精液管制作方法，本发明一种鸭冷冻精液的制备方法，通过该方法冷冻保存的精子，解冻后的精子活力可达到0.8以上，解冻后通过伊红‑苯胺黑染色精子，活率在60％以上，解冻并人工授精后，孵化率可达80％。该方法操作简单，不需昂贵仪器，可广泛用于鸭优质和濒危品种的精子冷冻保存，具有非常好的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种鸭冷冻精液的制备方法，属于水禽生物技术领域。

背景技术

家禽精液冷冻保存是禽类物种遗传资源长期保存的实用且有效的方法，但由于禽类精子的特殊性，虽然从20世界40年代至今，家禽精液冷冻保存被广泛研究，但目前仍然没有一套系统有效的冷冻方法能够使家禽冷冻精液达到较好而稳定的效果。

鸭的精子冷冻方法相关研究较少，虽然研究者们在精液稀释液，冷冻保护剂，冷冻速率，解冻方法等方面进行了一些研究，但冷冻后的精液受精率低、孵化率低、品种间差异大，目前仅限于实验研究阶段，未能广泛用于生产。

本发明提供一种鸭冷冻精液制作方法，可有效的提高鸭精液冷冻、解冻后的活力、活率，解冻后存活时间及人工输精后的受精率。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种鸭冷冻精液的制备方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种鸭冷冻精液的制备方法，包括以下步骤：

(1)称取D-果糖0.5-0.75g、谷氨酸钠0.6-0.9g、六水合氯化镁0.034-0.068g、醋酸钠0.2-0.43g、柠檬酸钠0.06-0.08g、磷酸二氢钾0.05-0.065g、磷酸氢二钠0.3-0.5g、N-三甲基-2-氨基乙磺酸0.15-0.2g、青霉素0.1g、链霉素0.1g和双蒸水100ml；

(2)将(1)所称取的原料溶解于100ml双蒸水中，调节PH值至7.0-7.4，制备得到鸭精子稀释液；

(3)人工诱导采集鸭精液，取少量步骤(2)中制备的鸭精子稀释液稀释鸭精液，显微镜下观察精子活力并进行计数，活力大于0.8的用于冷冻；

(4)根据计数结果用鸭精子稀释液将鸭精液按照1:1～3稀释，稀释后精液浓度为8-10×10⁸个/mL；

(5)按体积比向鸭精子稀释液中加入12-20％的冷冻保护剂DMA，然后放入4℃冰箱中预平衡1h，制备得到鸭精子冷冻保护液；

(6)将上述步骤(3)中获得的含精子的鸭精子稀释液与步骤(5)中获得的鸭精子冷冻保护液按1:1混匀，然后放入4℃冰箱中平衡30-60min；

(7)将步骤(6)中平衡后的含精子的鸭精子稀释液和鸭精子冷冻保护液一起吸入0.25mL的麦管中，制备得到冷冻精液管，将冷冻精液管置于液氮液面上方3cm处，平衡7min，投入液氮；

(8)将麦管投入液氮24h或以上时间后取出，迅速放进40℃水浴锅中30s，将麦管中的鸭精子转移至装有500μL体积的37℃鸭精子稀释液的1.5mL离心管中，2000转/min，离心1min，弃上清，重新加入250μL，37℃鸭精子稀释液，轻轻重悬精子。

进一步的，所述步骤(2)中鸭精子稀释液在使用前需在37℃下进行预温，然后将稀释后的鸭精液在4℃冰箱中平衡1h，使其缓慢降至4℃。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明一种鸭冷冻精液的制备方法，通过该方法冷冻保存的精子，解冻后的精子活力可达到0.8以上。

(2)通过该方法冷冻保存的精子，解冻后通过伊红-苯胺黑染色精子，活率在60％以上。