[发明专利]一种银鲳鱼物种鉴定用标准质粒分子及其应用

说明书

本发明公开了一种银鲳鱼物种鉴定用标准质粒分子及其应用，其空白载体为质粒载体pUC24‑R载体，包含有银鲳鱼细胞色素氧化酶亚基I基因序列，其全碱基序列如SEQ NO.1所示。本发明首次构建了含有银鲳鱼特异基因序列的标准质粒分子pUC‑SA。本发明构建的质粒分子pUC‑SA是一种适用于鱼种属鉴定的标准物质，可用于实时荧光PCR检测银鲳鱼成鱼、苗种、鱼卵、鱼肉及其加工产品等物种鉴定工作中的质量控制，适用性强、稳定性好，对实际样品的检测结果准确，很好的解决了银鲳鱼检测过程中阳性标准物质缺乏的问题，使得检测过程和检测结果有参考，保证鉴定结果的可靠性，填补了银鲳鱼检测领域的技术空白，具有极高的应用价值与市场前景。

技术领域

本发明涉及一种银鲳鱼物种鉴定用细胞色素氧化酶亚基I基因标准样品的建立，属于分子生物学领域。

背景技术

银鲳鱼(Pampus argenteus)，俗称车片鱼、白鲳、鲳鱼等，属于硬骨鱼纲，辐鳍亚纲，鲈形目，广泛分布于我国黄渤海、东海、南海，是作为海洋养殖的重要候选品种之一。其肉质鲜美且具有很高的营养价值而深受消费者喜爱，并且人工养殖困难，多数依靠海水捕捞，因此具有较高的经济价值。不少商家为了谋求高额利润，在海产品捕捞、加工处理、市场流通等环节，存在以次充好(如用较为便宜的金鲳代替银鲳)、乱贴标签的现象。因此，对银鲳的快速鉴定非常重要。

目前鉴定鱼类的方法主要有：传统的形态学鉴定分析，蛋白质分析和DNA检测。对传统形态特征的分析要求鉴定人员具有相当的专业背景，由于鱼类的多样性和形态可塑性，结果很容易受到主观判断的影响。尽管蛋白质方法操作方便，但鱼肉样品在处理后可能会变性或降解，因此结果不准确。关于DNA检测的报道很多，包括线粒体DNA(mtDNA)，限制性片段长度多态性(RFLP)，DNA条形码和微卫星。虽然这些方法具有高特异性和灵敏度，但它们存在耗时长、操作复杂、重复性差等缺点。

目前基于实时PCR的检测方法作为一种高效、快速、特异的检测技术，已被广泛用于鉴定肉类物种。然而在实际检测中，阳性标准样品非常关键，其中质粒标准物质是一种含有特异基因片段的重组DNA序列，它具有制备方便、操作简便、稳定性好、纯度高等优点，也被广泛应用在核酸检测标准品中，使得检测过程和检测结果有参考，从而保证鉴定结果的可靠性。目前国内有类似鱼类标准样品，如黑线鳕鱼核酸标准样品，但国内外尚无银鲳鱼核酸标准样品。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种银鲳鱼物种鉴定用标准质粒，解决银鲳鱼检测中标准物质缺乏的难题。

一种银鲳鱼物种鉴定用标准质粒分子pUC-SA，其空白载体为质粒载体pUC24-R载体，包含有银鲳鱼细胞色素氧化酶亚基I基因序列，其全碱基序列如SEQ NO.1所示。

上述标准质粒分子pUC-SA的构建方法，包括如下步骤：

(1)设计PCR特异性引物：根据银鲳鱼细胞色素氧化酶亚基I基因设计PCR特异引物：

SA-1F：5'-CACGAAATCACCACCCACGA-3'；

SA-1R：5'-CCTGTAAGAGGGGGGA-3'；

(2)获取目的片段：利用上述PCR特异性引物扩增目的片段；

(3)质粒的构建：上述得到的PCR产物回收后，通过连接酶连接到pUC24-R载体上；连接后的产物转化至大肠杆菌DH5α上培养，再提取核酸采用凝胶电泳法鉴定阳性质粒并测序验证，鉴定为阳性质粒的即为于银鲳鱼特异性质粒分子pUC-SA；

所述步骤(1)中，PCR特异性引物为一对，序列如下：

SA-1F：5'-CACGAAATCACCACCCACGA-3'；

SA-1R：5'-CCTGTAAGAGGGGGGA-3'；