[发明专利]一种银鲳鱼物种鉴定用标准质粒分子及其应用

权利要求书

1.一种银鲳鱼物种鉴定用标准质粒分子pUC-SA，其特征在于含有细胞色素氧化酶亚基I基因片段，其全碱基序列如SEQ NO.1所示。

2.一种权利要求1所述标准质粒分子pUC-SA的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）设计PCR特异性引物：根据银鲳鱼细胞色素氧化酶亚基I基因片段设计PCR特异引物：

SA-1F：5'-CACGAAATCACCACCCACGA-3'；

SA-1R：5'-CCTGTAAGAGGGGGGA-3'；

（2）获取目的片段：利用上述PCR特异性引物扩增目的片段；

（3）质粒的构建：上述得到的PCR产物回收后，通过连接酶连接到pUC24-R载体上；连接后的产物转化至大肠杆菌DH5α建立转化感受态细胞，37℃过夜培养，菌落PCR筛选阳性克隆，采用凝胶电泳法鉴定阳性质粒并测序验证，鉴定为阳性质粒的即为于银鲳鱼特异性质粒分子pUC-SA；

所述步骤(1)中，PCR特异性引物为一对，序列如下：

SA-1F：5'-CACGAAATCACCACCCACGA-3'；

SA-1R：5'- CCTGTAAGAGGGGGGA -3'；

所述步骤(2)中，获取目的片段的步骤如下：扩增所用引物为 SA-1F和SA-1R，扩增体系为2×Taq Master Mix 12.5μL，10μmol/L SA-1F引物1μL，10μmol/L SA-1R引物1μL，模板DNA 1μL，加水补足至 25μL；反应程序为：95℃ 3min预变性；95℃ 15s，58℃ 15s，72℃60s，重复30个循环；72℃ 5 min。

3.权利要求1所述标准质粒分子pUC-SA的均匀性检测方法，其特征在于包括如下步骤：随机抽样法抽取20管，编号201-220，每管重复检测3次；测试顺序：第1次，201~220；第2次，220~201；第3次，单数201~219，偶数202~220，分别检测质粒的质量与质量浓度，数据通过方差分析及F检验判断管间样品均匀性。

4.权利要求1所述标准质粒分子pUC-SA的稳定性检测方法，其特征在于包括如下步骤：（1）运输稳定性：随机抽取样本分别置于-20、0、4、25、37℃条件下，放置2周；每个温度下放置4管，进行质粒电泳观察条带完整性，并进行PCR扩增评估其扩增曲线一致性；（2）储存稳定性：在-20℃条件下，于5、10、15、20和25个月各时间点随机取样4管，每管重复测试3次质量和纯度，数据通过方差分析及F检验判断储存稳定性，并将质粒进行电泳观察条带完整性，并进行PCR扩增评估其扩增曲线一致性。

5.权利要求1所述标准质粒分子pUC-SA实时荧光PCR扩增评估方法，其特征在于包括如下步骤：采用TaqMan 探针实时荧光定量PCR反应体系的配置进行检测，检测体系为：PremixEx Taq PCR Mix 12.5μL，10µmol/L引物各1μL，10µmol/L 探针 0.5µL，质粒分子pUC-SA 2μL，加去离子水补足至 25μL；使用ABI 7500荧光定量PCR仪或QuantStudio™ 6 Flex进行扩增反应，反应程序如下：95℃反应10min；95℃反应15s，60℃反应 60s，45个循环，每循环延伸结束时收集荧光信号。

6.权利要求1所述标准质粒分子pUC-SA在定性检测银鲳鱼物种中的应用。