[发明专利]一种利用高通量测序分析玉露香梨贮藏期间果实菌群落结构的方法

说明书

本发明属于果实菌群落结构分析技术领域，本发明提供了一种利用高通量测序分析玉露香梨贮藏期间果实菌群落结构的方法。本发明以不同贮藏期的玉露香梨果实为试验材料，采用Illumina MiSeq高通量测序，分析不同贮藏时间玉露香梨果实菌群落结构组成及多样性变化。本发明为玉露香梨贮藏过程中生物拮抗菌的筛选提供了一定的理论基础。

技术领域

本发明涉及果实菌群落结构分析技术领域，尤其涉及一种利用高通量测序分析玉露香梨贮藏期间果实菌群落结构的方法。

背景技术

玉露香梨是山西省果农规模化生产的首要果品，具有皮薄、肉细、核小、可食率高、含糖量高等诸多优点，被国家梨产业体系专家公认为“中国第一梨”。然而因其果皮薄，营养物质丰富，在贮运过程中易受微生物侵染致病，常发的病害有梨黑星病、梨果肉褐变病、梨轮纹病、梨褐腐病、梨软腐病等，严重影响了果品的商品价值。

目前，梨采后病害已成为制约玉露香梨产业健康发展的重要因素，实际生产上一般采用化学农药防治，但农药的过量使用会导致病原菌产生耐药性，而且带来的农药残留以及环境污染，给梨果的绿色安全生产带来很大的威胁和风险。玉露香梨的生物防治的基础研究起步较晚，虽然在研究方法和思路上可以参考鸭梨、酥梨等，但是对梨果采后不同时期菌群落结构及多样性的研究尚未见报道。高通量测序技术为微生物多样性研究提供了更加可靠的技术支撑，目前已广泛应用于农业、工业、医疗、食品等领域。如何利用高通量测序技术分析玉露香梨采后不同时期菌群落结构及多样性对于玉露香梨果实品质及商品价值的提升具有重要意义。

发明内容

为克服现有技术中存在的上述缺陷，本发明以不同贮藏期的玉露香梨果实为试验材料，提供了一种利用IlluminaMiSeq高通量测序分析玉露香梨贮藏期间果实菌群落结构的方法。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种利用高通量测序分析玉露香梨贮藏期间果实菌群落结构的方法，包括如下步骤：

(1)将玉露香梨贮藏，每隔28～32d取样一次，共取样3～5次，得不同的玉露香梨样本；

(2)分别提取上述不同玉露香梨样本的微生物组总DNA，对所述微生物组总DNA进行PCR扩增，得PCR扩增产物；

(3)用上述所得的PCR扩增产物构建测序文库；

(4)对上述测序文库进行高通量测序，对测序数据进行OTU统计获得玉露香梨贮藏期间果实的菌群落结构。

优选的，步骤(1)中所述贮藏的温度为-2～2℃，所述贮藏的湿度为80～90％。

优选的，步骤(2)中所述PCR扩增的体系为步骤(2)中所述PCR扩增的体系为DNA 3～5μL，正向引物1～3μL，反向引物1～3μL，Premix Tap24～26μL和ddH₂O 16～18μL，所述正向引物序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，步骤(2)中所述PCR扩增的条件为93～95℃预变性4～6min，93～95℃变性50～60s，45～55℃退火45～55s，70～75℃延伸50～60s，循环30～35次，70～75℃延伸8～12min。

优选的，步骤(4)所述高通量测序过程中，目的片段的长度为200～500bp。

本发明的有益效果如下：