[发明专利]一种蛋白酶K突变体及其表达载体的构建和应用

说明书

本发明公开了一种蛋白酶K突变体及其表达载体的构建和应用，涉及生物工程技术领域，本发明提供了一种蛋白酶K突变体，其在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的基础上，具有如下至少一种突变：F371C和T373P，相对于野生型的蛋白酶K而言，具有更好的酶活，为蛋白酶K的应用和研究提供了途径。此外，本发明还提供了上述蛋白酶K突变体高拷贝表达载体的构建，提高了高表达菌体的筛选称功率，减少了大量筛菌的操作，为具有应用价值的蛋白酶K的工业化生产路线指明了方向。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体而言，涉及一种蛋白酶K突变体及其表达载体的构建和应用。

背景技术

蛋白酶K属丝氨酸蛋白酶类，它是林伯氏白色念球菌(Tritirachium albumLimber)产生的一类主要蛋白酶。因能合成该种蛋白酶的微生物能在以角蛋白(Kerantin)为唯一碳氮源的环境中生长，故将其称作蛋白酶K，其三维结构见图1。蛋白酶K具有极高的酶活性和广泛的底物特异性，能优先分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端邻接的酯键和肽键，常被用于降解蛋白生产短肽。它具有丝氨酸蛋白酶类所具有的典型催化三联体Asp39-His69-Ser224特征并且活性中心周围有两个Ca ²⁺结合位点以增加其稳定性，见图2，使其在更广泛的条件下保持较高的酶活力。蛋白酶K能将蛋白失活或降解，利用其这个特性，在核酸纯化、丝绸、医药、食品和酿造等领域蛋白酶K都有着重要的应用。

由于林伯氏白色念球菌生产比较缓慢，对于蛋白酶K的实际生产有着极大的限制。相关研究者在大肠杆菌中尝试了表达蛋白酶K，但是大多都已包涵体的形式存在，不利于工业生产。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蛋白酶K突变体及其表达载体的构建和应用。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供了一种蛋白酶K突变体，其在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的基础上，具有如下至少一种突变：F371C和T373P。

第二方面，本发明实施例提供了一种分离的核酸，其包括编码如前述实施例所述的蛋白酶K突变体的核酸序列。

第三方面，本发明实施例提供了一种重组载体，其含有如前述实施例所述的分离的核酸。

第四方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的重组载体的构建方法，其包括：将所述分离的核酸插入载体中，构建获得单拷贝重组载体。

第五方面，本发明实施例提供了一种基因工程菌，其含有如前述实施例所述的重组载体或如前述实施例所述的构建方法构建的重组载体。

第六方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的基因工程菌的构建方法，其包括将如前述实施例所述的重组载体或如前述实施例所述的构建方法构建的重组载体转化入菌体中获得基因工程菌。

第七方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的蛋白酶K突变体的制备方法，其包括：培养如前述实施例所述的基因工程菌或由前述实施例所述构建方法构建获得的基因工程菌，以诱导表达所述蛋白酶K突变体；或，在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的基础上，进行如下至少一种突变：F371C和T373P。

第八方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的蛋白酶K突变体或如前述实施例所述的基因工程菌或由前述实施例所述构建方法构建获得的基因工程菌在水解蛋白或制备用于水解蛋白的产品中的应用。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种蛋白酶K突变体，相对于野生型的蛋白酶K而言，具有更好的酶活，为蛋白酶K的应用和研究提供了途径。