[发明专利]一种从庆大霉素B菌株制备硫酸异帕米星的方法

说明书

本发明公开了一种自庆大霉素B菌株制备异帕米星的方法，包括以下步骤：将庆大霉素B菌株制成孢子悬浮液，接种于种子培养基中，33～37℃下摇床培养2～4天；将种子培养基接种于发酵罐里的发酵培养基中，33～37℃下发酵培养5～6天；发酵液经提取纯化后得到庆大霉素B。庆大霉素B上的羟基、氨基先经保护剂保护后再与侧链活性酯N‑取代苯酐‑(S)‑异丝氨酸‑N‑取代苯酐酯反应制备N‑取代苯酐异帕米星，在碱性条件下反应制备异帕米星，经酸化精制后得到硫酸异帕米星。制备出的硫酸异帕米星产品纯度高，收率高，且合成工艺路线操作过程简单，成本可控，并减少了高风险化学物质的使用，适合工业化批量生产。

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，尤其涉及一种从庆大霉素B菌株制备硫酸异帕米星的制备方法。

背景技术

庆大霉素B是一种氨基糖苷类抗生素，是通过绛红小单孢菌 (Micromonosporapurpurea)发酵生产的，而庆大霉素B是在庆大霉素产生菌发酵过程中产生的中间代谢产物，目前国内外生产庆大霉素B的菌种是通过菌种突变筛选获得的。

硫酸异帕米星(isepamicin)结构式见下式,是由日本旭化成制药株式会社和美国先令公司共同研发的半合成氨基糖苷类抗生素,是在庆大霉素 B(gentamicin B)的1位氨基上引入异丝氨酸所得，称为1-N[(S)-3-氨基-2- 羟基丙酰基]庆大霉素B(1-N-HAPAgentamicin B),临床所用为其硫酸盐。硫酸异帕米星为第3代氨基糖苷类抗生素,具有强效杀菌活性、耐药性低、不良反应小以及良好的抗生素后效应等优势,临床用于治疗各种感染，主要适用敏感菌引起的败血症、外伤、烫伤、手术引起的继发性感染、慢性支气管炎、支气管扩张、肺炎、肾盂肾炎、膀胱炎、腹膜炎。

美国专利US5442047A公开了一种硫酸异帕米星的制备方法，以庆大霉素B为起始物，首先与金属螯合剂反应，然后使用2-甲酰巯基苯并噻唑选择性保护庆大霉素B的3,6-氨基，再通过酰化反应在1-位氨基连接邻苯二甲酸酐保护的(S)-异丝氨酸，脱保护酸化即获得硫酸异帕米星。此外 CN105254688A公开了一种庆大霉素B经三甲基硅乙羰基氯保护后连上(S) -异丝氨酸的方法，CN102093444A公开了一种庆大霉素B与无极锌离子螯合后酰胺化再连上(S)-异丝氨酸的方法。

硫酸异帕米星是通过发酵得到的，在发酵过程中产生大量杂质，现有合成工艺路线基本都是以庆大霉素B为起始原料，存在成本高，生产周期长，产品纯度较低，收率不高的缺陷，不适合工业化批量生产，因此，进一步优化硫酸异帕米星的合成方法有迫切的需求。

发明内容

本发明目的在于提供一种从细胞菌株起始，制备硫酸异帕米星的方法，以对现有制备方法进行改进。

为实现上述目的，本发明提供了一种从庆大霉素B菌株制备硫酸异帕米星的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤(1)：将庆大霉素B菌株制成孢子悬浮液，接种于种子培养基中， 33～37℃下摇床220～280rpm培养2～4天；

步骤(2)：将种子培养基接种于发酵罐里的发酵培养基中，33～37℃下发酵5～6天，发酵完成后放罐，提取发酵液；

步骤(3)：向发酵液中加酸使其pH值为1.5～3，搅拌2～3小时，再向发酵液中加碱使其pH值为7～9，搅拌0.5～1小时，并向发酵液中加入阳离子交换树脂，树脂添加量为庆大霉素B发酵总重量的40～60倍，搅拌吸附10～16小时，至液相跟踪监测发酵液中无庆大霉素B单位；

步骤(4)：将吸附完成的树脂经漂洗后装柱，水洗后用浓氨水解析；

步骤(5)：氨水解析液通过浓缩后，用酸调节pH值为6～7，通过阳离子树脂进行柱分离，再用稀氨水进行解析，收集庆大霉素B组分段；

步骤(6)：将收集到的庆大霉素B组分段浓缩、结晶，得到庆大霉素 B；