[发明专利]一种SIGLEC15基因人源化动物模型的构建方法及应用

说明书

本发明通过筛选获得了用于小鼠高效同源重组的CRISPR‑CAS9靶标序列，进一步构建成功包含人Siglec‑15基因片段的小鼠同源重组载体，其可定向重组人Siglec‑15基因到小鼠Siglec‑15基因内，实现对小鼠基因组的人源化改造。通过CRISPR‑CAS9以及同源重组技术成功获得了人源化Siglec‑15基因的小鼠，该小鼠模型体内能正常表达人源的SIGLEC15蛋白。获得的SIGLEC15人源化小鼠可以应用于针对SIGLEC15信号机制研究，针对炎症、自身免疫行疾病、肿瘤和抗病毒的药物筛选和评价，无论对SIGLEC15基因功能机制还是药物研发都具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及人源化基因修饰动物模型的构建方法及应用，具体而言，涉及基于一种SIGLEC15基因人源化基因改造非人动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

背景技术

肿瘤细胞在发生发展过程中发展出各种免疫逃逸机制来逃避肿瘤微环境(TME)中针对肿瘤特异性和非特异性的攻击。因此，单纯的某一种免疫系统的全身性激活甚至外周肿瘤特异性T细胞的增加并不一定能介导肿瘤消退。同时，目前已知的癌症免疫逃逸策略也被用于维持体内的免疫系统稳态。为了杀伤肿瘤细胞，针对这些免疫逃逸机制，激活的非特异性免疫反应越多，发生不良事件的风险也就越高，进而导致治疗成功的可能性降低。

开发免疫正常化疗法的关键在于靶向肿瘤诱导的免疫逃逸机制，这些机制应限于TME，并选择性地恢复TME中针对肿瘤的免疫反应。因此，肿瘤免疫治疗正常化的靶标需要具备以下特点：1）由于肿瘤生长和/或随后的免疫监视而诱导产生；2）优先在TME中表达，在正常组织中不表达或少量表达；3）TME中的表达能够引发免疫逃逸，阻断或控制其表达可以重置或重编程TME中的抗肿瘤免疫。

肿瘤免疫治疗中，针对PD-L1/PD-1信号通路的免疫检查点抑制剂是最为成功的案例，阻断PD-L1/PD-1信号通路进行抗肿瘤治疗，即为肿瘤免疫治疗正常化的原型。PD-L1蛋白在正常人体组织中的表达水平很低，但在一些肿瘤患者中可以被选择性诱导过度表达，并且这种诱导局限于肿瘤微环境中。因此，阻断PD-L1/PD-1可避免全身过度免疫反应，避免对正常组织的严重损伤，同时又可以选择性地使TME中的免疫功能正常化和复位。然而，PD-L1/PD-1在人类实体肿瘤中只负责部分免疫功能失调，尽管针对该通路的抑制性药物取得了巨大成功，但只有30-40%的患者有响应，大多数患者表现出原发性或获得性耐药性。因此，需要在 TME 中鉴定新的下一代可媲美PD-L1/PD-1的免疫治疗靶标。

Siglec15 (S15) 为Siglec家族(唾液酸结合免疫球蛋白凝集素)的成员之一，该家族是免疫球蛋白(Ig)超家族蛋白的一个独特亚群，参与识别自身和非自身免疫调节。以前的研究表明，Siglec-15在破骨细胞分化和骨重建中的作用，但其免疫功能仍然很大程度上未知。2019年4月，Nature Medicine上刊登了陈列平教授团队的文章（Nature Medicine，volume 25, pages656–666 (2019)）。他们的研究表明，S15是一种关键的免疫抑制因子，其通常仅在某些骨髓细胞上表达，但在人类肿瘤细胞和肿瘤浸润性骨髓细胞上广泛上调，抑制肿瘤免疫，并且这种肿瘤抑制性能够以独立于PD-L1/PD-1通路的方式介导。此外，该研究显示S15敲除小鼠未发生自身免疫或其他疾病，表明Siglec15抑制可能不会引起正常细胞的不良反应。这些证据暗示，S15靶点可成为针对PD-1靶向治疗无应答的癌症患者的潜在治疗靶点，其可能是开发免疫系统正常化下一代免疫药物的一个重要靶点。目前针对S15靶点已有两个药物进入临床阶段，一个是美国NextCure公司开发的NC-318,处于临床II期阶段，一个是日本第一三共株式会社开发的DS-1501，处于临床I期阶段；国内也有多家公司针对S15靶点进行临床前的研发。