[发明专利]一种4-巯基尿嘧啶的双功能标记方法及其在序列富集与单碱基分辨测序中的应用

说明书

本发明公开的一种4‑巯基尿嘧啶的双功能标记方法及其在序列富集与单碱基分辨测序中的应用，属于核酸化学技术领域。本发明利用了N‑己‑5‑炔基‑2‑碘乙酰胺(E‑IAA)对4‑巯基尿嘧啶进行亲核取代反应从而实现双功能的标记，双功能体现在：末端的炔基可以与带有生物素的叠氮基团在温和的条件下进行高效交联，实现了对含有4‑巯基尿嘧啶的序列富集，近端的N‑H键可以改变4‑巯基尿嘧啶原本的碱基氢键配对模式，在其位置上产生T到C的突变，从而实现对4‑巯基尿嘧啶以及核酸衍生物的单碱基分辨。该双功能的标记反应效率高，且具有良好的生物兼容性。

技术领域

本发明属于核酸化学技术领域，具体涉及一种4-巯基尿嘧啶的双功能标记方法及其在序列富集与单碱基分辨测序中的应用。

背景技术

RNA修饰广泛的存在于生命体中并且在基本的生物过程中有重要调节功能。由于不同种类的RNA修饰其所存在的丰度大不相同，所以越来越多的测序技术来对转录组的RNA修饰进行检测。在这些RNA修饰中，4-巯基尿嘧啶对应衍生物4-巯基尿苷天然存在与大肠杆菌体内。另外4-巯基尿苷可以被广泛用于哺乳动物细胞的代谢标记来研究细胞转录组的动态。其中，在代谢标记过程中，仅有不到1％的总RNA或者更少的4-巯基尿苷被代谢标记到RNA上。所以越来越多的测序技术结合4-巯基尿苷的化学标记对其RNA序列分布信息和/或单碱基分辨率序列信息进行分析。

最初对4-巯基尿苷的检测是通过富集来实现的。4-巯基尿苷可以被一种通过二硫键连接的生物素的吡啶(HPDP-biotin)进行标记，当富集之后，DTT打断二硫键来释放富集到的含有4-巯基尿苷的RNA，但此方法的反应效率很低。随后，研究人员用甲基化的巯基生物素(MTS-bio)对含有4-巯基尿苷的RNA进行反应富集，此反应大大提高了标记效率。即使如此，生化反应富集的方法操作繁琐，会造成实验的重复性差，实用性低，另外，这种方法也不能对4-巯基尿苷进行单碱基识别，致使4-巯基尿苷代谢标记的位点数无法得到。

当前发展的一些方法能够对4-巯基尿苷进行单碱基识别。由于巯基是一种典型的亲核物质，碘代或溴代化合物很容易被巯基进攻。碘乙酰胺(IAA)通过亲核反应对4-巯基尿苷进行修饰产生一种与胞嘧啶结构相似的化合物，此化合物可以与G进行氢键配对，实现对4sU进行单碱基识别。同时，巯基的氧化亲核芳基取代机理也被挖掘出来，同时用氧化剂和亲核试剂对RNA 4-巯基尿苷进行反应在其位置上会产生胞嘧啶或类似于胞嘧啶的结构，这些方法也可以对 4-巯基尿苷进行单碱基识别。但这些方法目前也存在一定的局限性，是因为RNA 修饰通常在RNA中的丰度低，这些方法没有对目标序列进行富集的功能，大量的非目标核苷会对目标核苷的检测存在干扰。

因此，需要一种即可以进行序列富集又可以进行单碱基分辨的方法来检测 4-巯基尿嘧啶及其对应的核酸样品。

发明内容

本发明的目的在于提供一种4-巯基尿嘧啶的双功能标记方法及其在序列富集与单碱基分辨测序中的应用，能够解决现有技术只富集不进行单碱基分辨或只进行单碱基分辨而不富集的缺陷性问题。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开的一种4-巯基尿嘧啶的双功能标记方法，采用N-己-5-炔基-2- 碘乙酰胺对4-巯基尿嘧啶或4-巯基尿嘧啶的衍生物进行亲核取代反应，实现4- 巯基尿嘧啶的双功能标记；

其中，双功能标记的4-巯基尿嘧啶的结构中，末端的炔基能够与带有生物素的叠氮基团进行交联反应，近端的N-H键能够改变4-巯基尿嘧啶原本的碱基氢键配对模式，在聚合酶延伸过程中实现T到C的碱基转化。

优选地，亲核取代反应条件为：以RNA和N-己-5-炔基-2-碘乙酰胺为反应物，以质量浓度为10％的二甲亚砜水溶液作为反应溶剂，以pH值为8的磷酸钠作为缓冲液，在40～60℃的条件下反应20～40min。