[发明专利]一种4-巯基尿嘧啶的双功能标记方法及其在序列富集与单碱基分辨测序中的应用

权利要求书

1.一种4-巯基尿嘧啶的双功能标记方法，其特征在于，采用N-己-5-炔基-2-碘乙酰胺对4-巯基尿嘧啶或4-巯基尿嘧啶的衍生物进行亲核取代反应，实现4-巯基尿嘧啶的双功能标记；

其中，双功能标记的4-巯基尿嘧啶的结构中，末端的炔基能够与带有生物素的叠氮基团进行交联反应，近端的N-H键能够改变4-巯基尿嘧啶原本的碱基氢键配对模式，在聚合酶延伸过程中实现T到C的碱基转化。

2.根据权利要求1所述的4-巯基尿嘧啶的双功能标记方法，其特征在于，亲核取代反应条件为：以RNA和N-己-5-炔基-2-碘乙酰胺为反应物，以质量浓度为10％的二甲亚砜水溶液作为反应溶剂，以pH值为8的磷酸钠作为缓冲液，20mM的N-己-5-炔基-2-碘乙酰胺为反应物，在20～40℃的条件下反应20～40min。

3.根据权利要求1所述的4-巯基尿嘧啶的双功能标记方法，其特征在于，亲核取代反应后的RNA采用虾碱性磷酸酶和RNaseI降解为核苷，用LC-MS/MS进行表征检测，得到4-巯基尿苷的双功能标记产物。

4.基于权利要求1～3中任意一项所述的双功能标记方法标记后的4-巯基尿嘧啶在序列富集中的应用，其特征在于，在被标记的4-巯基尿嘧啶的结构中，末端的炔基与带有生物素的叠氮基团在温和的条件下实现交联反应，对4-巯基尿嘧啶的相关序列进行富集。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，将4-巯基尿苷的双功能标记产物与二硫化生物素叠氮化合物N₃-S-S-bio进行反应，反应条件如下：

采用二价铜离子作为催化剂，加入10mM的抗坏血酸钠，避光在37℃的条件下反应1h，随后在反应体系中加入100mM的DTT，继续在37℃下反应30min，最后反应产物用Ms表征，得到标记的4-巯基尿嘧啶与叠氮化合物的交联产物。

6.基于权利要求1～3中任意一项所述的双功能标记方法标记后的4-巯基尿嘧啶在单碱基分辨测序中的应用，其特征在于，在被标记的4-巯基尿嘧啶的结构中，近端的N-H键能够改变4-巯基尿嘧啶原本的碱基氢键配对模式，在聚合酶延伸过程中实现T到C的碱基转化，通过测序实现4-巯基尿嘧啶的单碱基分辨。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，将经过4-巯基尿苷双功能标记的RNA分别用逆转录酶ProtoScriptⅡ、SuperScriptⅡ和DNA聚合酶Bst 3.0进行逆转录PCR，用测序来表征4-巯基尿嘧啶的碱基氢键配对模式由原来的A:T配对变为C:G配对，实现4-巯基尿嘧啶位置的单碱基分辨。

8.一种基于双功能标记的4-巯基尿嘧进行序列富集和单碱基分辨的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将含有不同比例的4-巯基尿嘧RNA的混合样品分别与N-己-5-炔基-2-碘乙酰胺进行反应；

2)将步骤1)反应得到的RNA与二硫化生物素叠氮化合物进行反应实现RNA的生物素化；

3)采用链霉亲和素磁珠将经步骤2)生物素化的RNA进行富集，最后采用DTT将二硫键打断使富集的序列从磁珠上释放出来；

4)对富集的序列进行逆转录、PCR，最终通过测序实现含有4-巯基尿嘧啶的序列的单碱基分辨。

9.根据权利要求8所述的基于双功能标记的4-巯基尿嘧进行序列富集和单碱基分辨的方法，其特征在于，步骤1)中，具体操作为：

体外分别转录含有4-巯基尿嘧啶和尿嘧啶的RNA，将含有4-巯基尿嘧啶的RNA分别按1/10，1/100，/1000，1/10000和1/20000的比例混到含有尿嘧啶的RNA中，得到五组混合样品。