[发明专利]一种用于结直肠癌早期预警和临床诊断的引物探针组合

说明书

一种用于结直肠癌早期预警和临床诊断的引物探针组合，属于基因检测技术领域。本发明一方面提供了用于结直肠癌早期预警和临床诊断的引物探针组合，其包括USP44基因的甲基化引物和探针，另一方面提供了该引物探针组合的应用。本发明探寻了一个具有较高灵敏度和特异性的可用于结直肠癌早期预警和临床诊断的肿瘤标志物，并开发了引物探针组合，其能够用于结直肠癌早期预警和临床诊断。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种用于结直肠癌早期预警和临床诊断的引物探针组合。

背景技术

结直肠癌目前已成为世界第三大癌症，并且是消化系统最为常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率极高。结直肠癌的发生是由于多个基因的表达发生了变化，与癌症的发生密切相关的因素有环境因素、后天的生活习惯和饮食因素等。导致结直肠癌在确诊时通常已是疾病中晚期的原因有很多，主要原因有早期没有明显症状，筛查方法不够便捷等。这些因素通常导致预后不佳和病人生活质量下降。

肿瘤标志物的优点有检测方便、便于普查、微创、费用低、高敏感性、高特异性等。多个基因的损伤是导致结直肠癌发生发展的原因。基因启动子区域呈现出甲基化水平升高的本质是DNA分子异常，这是导致许多抑癌基因表达失活的重要原因之一。在正常组织细胞中，基因调控区CpG岛处于非甲基化状态，而当细胞发生癌变后，这些CpG岛区域往往出现高度甲基化，目前DNA甲基化研究是肿瘤分子生物学研究的一个重要领域。基因的甲基化水平升高一般和肿瘤的发生相关，可以用于肿瘤的早期诊断，成为重要的分子生物学标记。在肿瘤早期基因的启动子区域常发生异常甲基化，这为大多数肿瘤的早期诊断、转归和疗效的评价提供了一个研究思路。

检测启动子异常甲基化与其它类型的肿瘤分子标记物相比有更多的优点。在几乎所有种类的肿瘤中都存在基因启动子的甲基化水平异常。更为重要的是，在外周血中也能发现癌变细胞所释放的DNA。经过之前的实验研究，可以发现外周血血浆、血清、肿瘤累及器官相关的体液(如唾液、痰、尿液、大便等)中同样可以检测到肿瘤组织中存在的肿瘤相关基因的启动子异常甲基化。然而这些生物样品的获得是相对比较容易的，因此检测其中某些肿瘤相关基因的启动子区甲基化状态，可以成为肿瘤早期诊断的依据。基因的启动子异常甲基化区域在不同类型肿瘤中是相同的，这也为检测提供了方便。与等位基因缺失这样的标志物相比，异常甲基化是一个阳性信号，很容易与正常组织中的阴性背景区分。

2000年，由Eads等人建立了基于TaqMan探针的甲基化特异性定量PCR技术MethyLight。它具有高通量，高灵敏，操作简便等优点，即使在非甲基化等位基因比例很高的情况下亦能精确地检测到甲基化的等位基因，而且可以做多样本、多基因位点的快速分析。此外该法具备可重复、所需样本量少、不需要电泳分离的特点，可以为临床样本的研究提供可靠的技术支持。样品容易获得且用量少。

甲基化DNA免疫共沉淀法(MeDIP-chip)是目前应用最广泛的检测技术之一，它是基于免疫共沉淀及芯片位点针杂交原理。MeDIP-chip通过5'-甲基胞嘧啶抗体特异性富集基因组上发生甲基化的DNA片段。采用NimbleScan进行图像分析，将图像信号转化为数字信号，经过校正后计算出Cy3通道(IP样品)与Cy5通道(Input样品)的信号值比值。研究人员可以利用MeDIP-chip技术快速有效地寻找基因组上的甲基化区域，从而比较不同细胞、组织或疾病样本间的DNA甲基化修饰模式的差异。MeDIP-chip能够同时检测大量位点的甲基化状态，但是价格昂贵，应用于临床检测成本高。

本发明将系统分析相关基因在正常结直肠粘膜与结直肠癌组织中的甲基化表达差异，并结合临床资料，探寻一个具有较高灵敏度和特异性的可用于结直肠癌早期预警和临床诊断的肿瘤标志物。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种用于结直肠癌早期预警和临床诊断的引物探针组合的技术方案。

本发明具体通过以下技术方案实现：