[发明专利]一种托品酮的合成方法

说明书

本发明公开了一种托品酮的合成方法，合成生物学和酶催化技术领域。本发明通过联用能产生4‑(1‑甲基‑2‑吡咯烷基)‑3‑氧代丁酸的工程菌株与能催化4‑(1‑甲基‑2‑吡咯烷基)‑3‑氧代丁酸转化成托品酮的单胺氧化酶合成了托品酮。所述的工程菌株含有合成4‑(1‑甲基‑2‑吡咯烷基)‑3‑氧代丁酸的相关基因；所述的单胺氧化酶为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白质(即MAO‑N)。本发明为托品酮的合成提供了一条绿色高效的新路线，具有较好的工业应用前景。

技术领域

本发明属于合成生物学和酶催化技术领域，更具体地，涉及一种托品酮的合成方法。

背景技术

托品酮(Tropinone)是一类植物来源含有叔胺结构的莨菪烷类生物碱，可以用于合成阿托品等天然托品烷类药物，其化学名称为8-甲基-8氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-酮。目前托品烷类药物主要是从植物中提取得到。虽然化学家们很早就已经实现了托品酮的化学全合成(Robinson,R.LXIII.A synthesis of tropinone.Chem.Soc.,Trans.,1917,111,762-768.)，但是因难以控制后续合成托品烷类药物的手性结构，环境污染等问题而没有得到很好的应用。因此，研究者们开始关注托品烷类天然产物的生物合成途径解析以及生物合成方法，期望能获得更加绿色高效的合成方法。

近年来发展的合成生物学技术，通过将目标化合物生物合成途径上相关的基因导入微生物底盘中，实现了一些植物来源重要药用化合物的异源高效合成(Kotopka,B.J.etal.Synthetic biology strategies toward heterologous phytochemicalproduction.Natural product reports 2018,35,902-920；Li,S.et al.Strategies formicrobial synthesis of highvalue phytochemicals.Nature Chemistry 2018,10,395-404.)。随着托品酮生物合成途径被阐明，合成生物学家们也通过模拟托品酮的天然生物合成途径，将相关的合成基因导入异源微生物底盘中，实现了托品酮的微生物合成(图2)，然而效率都十分的低下(Huang,J.et al.Tropane alkaloids biosynthesis involves anunusual typeⅠIⅠpolyketide synthase and non-enzymatic condensation.NatureCommunications,2019,10,4036；Ping,Y.et al.Building Microbial Hosts forHeterologous Production of N-Methylpyrrolinium.[J].ACS Synthetic Biology,2019,8,257-263；Ping,Y.et al.De Novo Production of the Plant-Derived Tropineand Pseudotropine in Yeast.ACS Synthetic Biology,2019,8,1257-1262；CN111826355 A)。

已有研究表明，无论在植物还是微生物代谢工程中，托品酮生物合成均是托品烷类天然产物生物合成的关键限速步骤，极大地限制了下游药用托品烷生物碱的积累。而托品酮生物合成的最关键的限速步骤就是细胞色素P450介导的催化4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸形成托品酮这一步。植物的P450为膜蛋白，具有表达量低下、不够稳定，以及难以利用酶工程改造等缺陷。近期我们筛选到一种黄素依赖型的单胺氧化酶(monoamineoxidase，MAO)可以替代原本的P450催化4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸形成托品酮，使得该步合成效率有了显著提升。基于上述背景，本发明将该单胺氧化酶与可合成4-(1-甲基-2-吡咯烷基)-3-氧代丁酸的工程菌株巧妙的联合使用，获得了托品酮从头合成的新路线，使得托品酮的产量相较于原本途径有了显著，为托品类药物微生物生产工艺的发展奠定了基础。

发明内容