[发明专利]测定单细胞亚群的基因表达的方法及相关试剂盒和应用

说明书

本申请提供了外周血样本分析方法以及用于测定基因转录本丰度的试剂成分在制备用于外周血样本分析方法的试剂盒中的用途。本申请还提供了包含用于定量基因转录本丰度的试剂成分的试剂盒以及用于定量基因转录本丰度的试剂成分在制备用于对体温异常患者进行鉴别和分流的试剂盒或药物中的应用。

发明领域

本申请涉及生物检测和分析领域，具体地，涉及测定单细胞亚群 的基因表达的方法及相关试剂盒和应用。

发明背景

外周血的检测和分析是医学检查的一个重要方面。外周血由各种白 细胞亚群(leukocyte subpopulations)组成，例如嗜中性粒细胞、淋巴细 胞和单核细胞(monocyte，又称为单核白细胞、单核白血细胞、单核细 胞或单核球)，因此外周血是一种细胞混合物的样本。单细胞亚群或单 细胞类型(single cell subpopulation or single cell-type)的基因表达是良好 的生物标志物，但是现有的方法不能直接从外周血的细胞混合物样本 中检测到。为了获得单细胞亚群的基因表达水平，传统方法需要事先 分离指定细胞类型的亚群。最近，另一种称为单细胞RNA测序(single cell RNA-sequencing，scRNA-seq)的方法也可能获得单细胞的基因表达 信息。单细胞RNA测序通过使用价格昂贵的设备和试剂，生成每个细 胞的基因表达数据。然而，由于较高的成本，这种技术一般只在研究 中使用，不适宜大量临床应用。

一些方法可以直接测量细胞混合物样本中选定的单细胞亚群的信息 基因(single cell-type informative genes)，而无需分离目标细胞亚群。它还 避免了使用单细胞RNA-seq的昂贵设备。具体参见专利文献 CN103764848B(申请日2012年7月23日，公开日2014年4月30日)； 和US9589099B2(申请日2012年7月20日，公开日2017年3月7日)。 这种新的检测方法称为“直接白细胞亚群的转录本丰度”检测(Direct LeukocyteSubpopulation Transcript Abundance assay,或简称Direct LS-TA assay)。这种“直接白细胞亚群的转录本丰度”检测的目标是评估单种细胞 亚群的所有同类型细胞(例如，所有B-淋巴细胞)的平均基因表达，而不像scRNA-seq对每个细胞都进行测序来检测每个细胞的转录本丰度。然而之 前的方法(如CN103764848B和US9589099B2中公开的那些方法)并没有 关注单核细胞这一种细胞亚群。

发热是一种常见的临床症状。然而，导致发热的原因有很多，重 要的临床诊断可以大概分为几个大类：(1)细菌感染，例如由诸如葡萄 球菌、链球菌、meliodiosis、嗜血杆菌的细菌引起的肺炎或其它感染； (2)由流感病毒、RSV等引起的病毒感染；(3)肺结核，例如，结核病和 活动性肺结核，但不包括潜伏结核(Latent TB)感染；以及(4)自身免疫 疾病，例如系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)。

外周血内各种白细胞亚群对不同疾病的反应不同。虽然最终都引 起发热症状，但由于病原体或者病因不同，导致的细胞反应各异。虽 然有很多临床指标和临床症状(其是医生一直使用的)可以有助于辨别 发热原因，但除了临床症状之外，如果存在辨症或者鉴别的检测从而 依照各大类病因对病人进行鉴别，对于医生的工作是有帮助的。现有 的检测，包括各种血清蛋白(例如CRP补体)、炎症反应蛋白例如细胞 因子、全血细胞计数(血常规全血细胞计数)、血沉(ESR)等均不是特异 性指标，最终的临床判断和鉴别还需要医生的经验来判断。同时，这 些现有的临床检测基本上没有关注外周血内的各成分白细胞亚群的基 因改变或者功能指征。例如，各种血清检测实际上仅使用把所有白细 胞直接分离出来和丢弃后剩下的血清，血常规则只关注外周血内各种 白细胞亚群的细胞计数或细胞计数占比，却不能反映各种白细胞亚群 功能的改变。