[发明专利]一种基于微量液体培养基鉴定鼠疫噬菌体宿主谱的方法

权利要求书

1.一种基于微量液体培养基鉴定鼠疫噬菌体宿主谱的方法，其特征在于，具体步骤包括如下：

步骤1，将分离的野生型鼠疫噬菌体纯化，使其增殖，根据野生型鼠疫噬菌体的生长条件选择液体检测法或者半固体培养法测定效价，使其效价达10⁶以上，备用；

步骤2，选取实验用鼠疫菌/非鼠疫菌拟作为宿主菌，勾取菌苔于新鲜LB液体培养基中，置于28℃空气浴振荡培养箱，120r/min振荡培养18～20h至对数生长期备用；在加入无菌96孔微量培养板之前菌悬液中加入四唑类染料，使四唑类染料最终浓度为20％；

步骤3，无菌96孔微量培养板的第1列孔中分别加入步骤1增殖后的100ul野生型鼠疫噬菌体，根据野生型鼠疫噬菌体效价，自由确定向第2至5列孔各孔中分别加入90ul LB液体培养基进行稀释；

步骤4，从第1列试验孔中分别取10ul野生型鼠疫噬菌体加入第2列试验孔中，用LB液体培养基作为稀释液进行10倍稀释，相同倍数依次稀释至第5列试验孔，第5列试验孔液体混匀后弃去10ul稀释液；

步骤5，取步骤2含四唑类染料的菌悬液10ul，分别加入无菌96孔微量培养板的每行第1-6列试验孔中，每行中添加有1株实验用鼠疫菌或非鼠疫菌；

步骤6，设1行作为空白对照组，每个试验列孔加入98ul新鲜LB液体培养基，再加入2ul四唑类染料；另设1行中的4个试验孔作为阴性对照，依次为3株待测野生型鼠疫噬菌体和1株实验室诊断用鼠疫噬菌体，每孔加入对应的98ul鼠疫噬菌体和2ul四唑类染料；

步骤7，分别将96孔微量培养板板口密封，置于OmniLogTM系统，33℃运行48h读数，观察各组的表型反应的动力学图，从而定量测定表型反应的强弱。

2.根据权利要求1所述的一种基于微量液体培养基鉴定鼠疫噬菌体宿主谱的方法，其特征在于，所述步骤5中，每行所添加的实验用鼠疫菌或非鼠疫菌依次鼠疫疫苗株EV₇₆、弱毒鼠疫菌614F、假结核耶尔森菌PTB3、假结核耶尔森菌PTB5、大肠杆菌V517、小肠结肠炎菌52302-2。

3.根据权利要求1所述的一种基于微量液体培养基鉴定鼠疫噬菌体宿主谱的方法，其特征在于，所述步骤6中，待测野生型鼠疫噬菌体为来自天峻县鼠疫疫源地的476号野生型鼠疫噬菌体和087号野生型鼠疫噬菌体；来自同德县鼠疫疫源地072204号野生型鼠疫噬菌体；所述实验室诊断用鼠疫噬菌体来自鼠疫菌专业实验室。