[发明专利]一种检测图拉病毒的RAA引物探针及检测方法

说明书

一种检测图拉病毒的RAA引物探针及检测方法，可实现在39℃条件下20min内完成JUNV的检测，具有快速、灵敏、操作简便、适用于现场快速检测的特点。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种检测图拉病毒的RAA引物探针及检测方法。

背景技术

图拉病毒（Tula virus，TULV）是汉坦病毒科汉坦病毒属的一个成员，从田鼠（micotus arvalis）中分离出该病毒。TULV病毒是欧亚大陆不同地区广泛分布的一种病毒，普通田鼠是其宿主，但也在其他田鼠中发现该病毒。TULV病毒致病性的临床表现非常罕见。2003年，通过血清学和分子流行病学方法诊断出一例与TULV病毒相关的汉坦病毒病。到目前为止，仅在2例中发现与TULV病毒感染的直接分子证据，1例为患有严重汉坦病毒病的免疫功能低下患者，另一例为患有轻度汉坦病毒病的免疫功能正常者。TULV病毒即使在健康的人身上也能引起汉坦病毒病，这表明了这种病毒的致病潜力。因此，携带TULV病毒的田鼠应被视为潜在感染源，应该被认为是对人类健康的威胁。

目前，实验室对于TULV的诊断主要有分子生物学检测和血清学检测。一般可以通过荧光抗体检测试验、电子显微镜观察和分子检测进行病毒鉴定。也可用病毒中和试验或间接ELISA检测急性和康复阶段血清中的抗体。

常规病毒检测方法中病毒分离与鉴定、血清中和抗体试验难以广泛使用，不适合大规模流行病学调查或现场快速诊断。而酶联免疫吸附检测(ELISA)特异性较差，存在交叉反应，易出现假阳性。荧光定量PCR方法虽然特异性和敏感性均较高，重复性好，但仍然具有仪器昂贵、巨大、对实验场地、人员要求高的问题，难以适用于现场大规模筛查，检测时间偏长，需要1～2小时。所有上述方法都不适合在口岸现场使用，而且这些方法需要操作熟练的人员和设备齐全的实验室；因此，基于现有检测技术存在时间长、操作不方便及假阳性高等缺点，提供一种准确、灵敏、操作简便、适用于现场快速检测TULV的荧光RT-RAA法，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种荧光RT-RAA法检测JUNV的引物、探针及检测方法，可实现在39°C条件下20min内完成JUNV的检测，具有快速、灵敏、操作简便、适用于现场快速检测的特点。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明首先提供一种检测JUNV的荧光RT-RAA法扩增用引物和探针；

具体的，所述的引物包含有：

上游引物：5’-AGGGTCAGTGGCTGGTCCTTCAATGTCGAG-3’；

下游引物：5’-GGGACAACACAAGTATTGATCTGACAAGGA-3’；

本发明还提供用于检测上述引物扩增产物的探针，所述探针的序列如下：5’-TCGAGTTTCCCCACTGCCTCTCTGATGACAGCTTCTTGTATCTCTGTCAAG-3’；

所述探针采用荧光报告基团和荧光淬灭基团进行修饰，荧光报告基团修饰在探针序列离5′端碱基数35bp的位置上；荧光淬灭基团修饰在探针序列离3′端碱基数15bp的位置上，荧光报告基团与淬灭基团之间间隔1个碱基C，其中C用THF替换；

修饰后的探针为：5’-TCGAGTTTCCCCACTGCCTCTCTGATGACAGCT

/i6FAMdT/THF/iBHQ1dT/TGTATCTCTGTCAAG-3’。

进一步，所述荧光报告基团为FAM、HEX、TET、JOE或VIC；所述荧光淬灭基团为BHQ1、BHQ2或BHQ3。

优选地，所述荧光报告基团为FAM；所述荧光淬灭基团为BHQ1。

上述的引物和探针用于制备荧光RT-RAA检测试剂盒。

进一步，本发明还提供一种荧光RT-RAA法检测JUNV的方法，具体步骤如下：

1) 提取待检测样本的核酸；