[发明专利]一种新冠病毒感染致死性小鼠动物模型及其构建方法

说明书

本发明公开了一种新冠病毒感染致死性小鼠动物模型及其构建方法，构建方法包括如下步骤：以化学合成的人ACE2基因CDS区序列为模板，进行hACE2基因序列扩增；使用限制性内切酶对pCAG‑EGFP‑N1质粒和hACE2扩增产物进行酶切，胶回收目的DNA片段；pCAG‑EGFP‑N1的DNA片段和hACE2的DNA片段酶连接，得到pCAG‑hACE2‑N1质粒载体，再次酶切和胶回收，得到线性化的注射DNA片段；将注射DNA片段注射到小鼠受精卵的细胞核内，将注射后的小鼠受精卵移植到假孕小鼠的体内，得到首建鼠，进行传代，感染并筛选出新冠病毒感染致死的小鼠，得到新冠病毒感染致死性小鼠动物模型。

技术领域

本发明属于在基因工程的领域，具体涉及一种新冠病毒感染致死性小鼠动物模型及其构建方法。

背景技术

COVID-19的病原体为严重急性呼吸系统综合症相关冠状病毒(SARSr-CoV)，命名为SARS-CoV-2。尽管为控制该疾病做出了相当大的努力，但该病毒仍在许多国家继续流行，具有不同程度的临床表现。SARS-CoV-2入院患者表现出肺炎症状，胸部CT扫描结果异常；其感染的临床症状从无症状到有症状不等，包括呼吸道症状、发烧、呼吸急促、咳嗽、呼吸困难和病毒性肺炎，在严重的情况下，肺炎、严重急性呼吸系统综合症、心力衰竭、肾功能衰竭，甚至死亡。与COVID-19相关的主要死亡原因是呼吸衰竭，其次是感染性休克、肾衰竭、出血和心力衰竭。

冠状病毒是有包膜的、基因组为线性单股正链的RNA病毒，属于Nidovirales目中的冠状病毒科。该病毒有四个属，即alpha(α)、beta(β)、gamma (γ)和delta(δ)。然而，新型SARS-CoV-2属于β-冠状病毒属，其RNA基因组大小为29.9kb。SARS-CoV-2是继SARS-CoV和MERS-CoV之后的第3 种高致病性冠状病毒。据报道，SARS-CoV-2与SARS-CoV的序列相似性为79％，与MERS-CoV的相似性为50％。越来越多的研究表明，SARS-CoV-2 和SARS-CoV和MERS-CoV一样，是通过血管紧张素转换酶2(ACE2)进入细胞，并感染机体，但具体发病机制尚不完全明确。此外是，尽管SARS-CoV-2 和SARS-CoV之间具有受体结合域(RBD)结构同源性，但一些已发表的 SARS-CoV RBD单克隆抗体仍无法中和SARS-CoV-2。因此我们需要更多的动物感染模型来了解病毒发病机制、疫苗开发和药物筛选。

然而，之前的研究表明，SARS-CoV-2可以使用人类、蝙蝠或果子狸 ACE2作为细胞受体，但不能使用小鼠ACE2作为受体。非人类灵长类动物也有助于临床前评估，但非人灵长类、蝙蝠和果子狸受到实验室动物应用范围、成本、饲养等条件的限制，无法广泛应用于实验研究，而作为最常使用的实验动物，SARS-CoV-2在小鼠中复制能力很差，基本上不感染。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种新冠病毒感染致死性小鼠动物模型及其构建方法，构建表达hACE2蛋白的小鼠，为SARS-CoV-2发病机制、疫苗开发和药物筛选提供新型实验动物模型。

为了实现上述目的，本发明提供的一种新冠病毒感染致死性小鼠动物模型的构建方法，包括如下步骤：

(1)以化学合成的人ACE2基因CDS区序列为模板，进行hACE2基因序列扩增，得到hACE2扩增产物；

(2)使用EcoRI限制性内切酶and NotI限制性内切酶对pCAG-EGFP-N1 质粒进行酶切；

(3)使用EcoRI限制性内切酶and NotI限制性内切酶对步骤(1)得到的hACE2扩增产物进行酶切；

(4)胶回收步骤(2)酶切的pCAG-EGFP-N1质粒载体，得到pCAG-EGFP-N1的DNA片段，胶回收步骤(3)酶切的hACE2扩增产物，得到hACE2的DNA片段；