[发明专利]一种新冠病毒感染致死性小鼠动物模型及其构建方法

权利要求书

1.一种新冠病毒感染致死性小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以化学合成的人ACE2基因CDS区序列为模板，进行hACE2基因序列扩增，得到hACE2扩增产物；

(2)使用EcoRI限制性内切酶和NotI限制性内切酶对pCAG-EGFP-N1质粒进行酶切；

(3)使用EcoRI限制性内切酶和NotI限制性内切酶对步骤(1)得到的hACE2扩增产物进行酶切；

(4)胶回收步骤(2)酶切的pCAG-EGFP-N1质粒载体，得到pCAG-EGFP-N1的DNA片段，胶回收步骤(3)酶切的hACE2扩增产物，得到hACE2的DNA片段；

(5)使用连接酶将步骤(4)得到的pCAG-EGFP-N1的DNA片段和hACE2的DNA片段酶连接，得到pCAG-hACE2-N1质粒载体；

(6)使用SpeI限制性内切酶和AflII限制性内切酶对步骤(5)得到的pCAG-hACE2-N1质粒载体进行酶切；

(7)胶回收步骤(6)酶切的pCAG-hACE2-N1质粒载体，得到线性化的注射DNA片段。

(8)取小鼠受精卵，将步骤(7)得到的注射DNA片段注射到小鼠受精卵的细胞核内，将注射后的小鼠受精卵移植到假孕小鼠的体内，得到首建鼠，首建鼠进行传代；

(9)步骤(8)得到的首建鼠传代繁育的小鼠感染新冠病毒，筛选出新冠病毒感染致死的小鼠，得到新冠病毒感染致死性小鼠动物模型。

2.根据权利要求1所述的新冠病毒感染致死性小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)的扩增体系中包括基因正向引物序列、基因反向引物序列和PCR反应体系，其中

基因正向引物序列hACE2-F：SEQ ID NO.1，

基因反向引物序列hACE2-R：SEQ ID NO.2。

3.根据权利要求1所述的新冠病毒感染致死性小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，步骤(1)中得到的所述hACE2扩增产物的序列为SEQ ID NO.3。

4.根据权利要求1所述的新冠病毒感染致死性小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，步骤(5)得到pCAG-hACE2-N1质粒载体的序列为SEQ ID NO.4。

5.根据权利要求1所述的新冠病毒感染致死性小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，步骤(5)中所述pCAG-EGFP-N1的DNA片段和所述hACE2的DNA片段通过T4 DNA连接酶进行酶连接。

6.根据权利要求1所述的新冠病毒感染致死性小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，步骤(8)得到的首建鼠和步骤(9)中传代繁育的小鼠在感染新冠病毒前进行基因型鉴定。

7.根据权利要求6所述的新冠病毒感染致死性小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述首建鼠和所述传代繁育的小鼠通过PCR方法进行基因型鉴定，其中正向鉴定引物序列为SEQ ID NO.5，反向鉴定引物序列为SEQ ID NO.6。

8.根据权利要求1所述的新冠病毒感染致死性小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，步骤(8)中所述注射DNA片段以100ng/uL的浓度注射到小鼠受精卵的细胞核内。

9.根据权利要求1所述的新冠病毒感染致死性小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，步骤(8)中小鼠受精卵的获取，包括以下步骤：取4-5周龄的雌性小鼠，注射孕马血清促性腺激素10IU，间隔46-48小时后，注射人绒毛膜促性腺激素10IU，注射激素后的雌性小鼠与10周龄以上雄性小鼠合笼10-12小时，检栓，取受精卵。

10.一种新冠病毒感染致死性小鼠动物模型，其特征在于，根据权利要求1-9任一项所述的新冠病毒感染致死性小鼠动物模型的构建方法构建。