[发明专利]泡桐丛枝植原体胸苷酸合成酶融合蛋白、多克隆抗体及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及泡桐丛枝植原体胸苷酸合成酶融合蛋白、多克隆抗体及其制备方法和应用。构建了泡桐丛枝植原体胸苷酸合成酶的原核表达载体，诱导表达并纯化获得了6×His/PaWB thyA‑1融合蛋白和6×His/PaWB thyA‑2融合蛋白；以融合蛋白为免疫原免疫兔获得了兔多克隆抗体；该多克隆抗体与PaWBthyA‑1蛋白和PaWB thyA‑2蛋白均可发生免疫反应；借助免疫印迹法、免疫荧光显微镜法、免疫电子显微镜法，证明该多克隆抗体可较好地用于泡桐丛枝植原体及其胸苷酸合成酶表达的检测。本发明为进一步研究植原体增殖致病机理奠定了基础，也为实际生产中检测泡桐丛枝植原体提供了新的技术手段。

技术领域

本发明涉及泡桐丛枝植原体检测技术领域，具体地说，是泡桐丛枝植原体胸苷酸合成酶融合蛋白、多克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

泡桐丛枝病(Paulownia Witches’-Broom，简称PaWB)是由泡桐丛枝植原体侵染导致的一种重要林木病害。据报道，该病害分布在我国20个省份，影响树的正常生长和开花，破坏树的干形和冠形，降低木材的产量与质量，降低了其观赏价值和空气净化能力，病害可导致幼苗和幼龄树死亡，因而对该病害基础理论和防治技术的研究具有重要意义。

植原体是一种无细胞壁的植物病原原核生物，寄生于寄主植物韧皮部筛管、伴胞和宿主昆虫的肠道、唾液腺中。研究表明，寄主植物的植原体增殖到一定浓度是该病害发生的基础，因此，对植原体增殖的分子水平研究可为控制植原体增殖进而控制该病害提供策略。植原体增殖离不开其DNA合成，DNA合成需要四种脱氧核糖核苷酸参与，其中dTTP的合成需要多种酶参与，胸苷酸合成酶(Thymidylate Synthase，简称ThyA)是该合成途径中的重要酶。前期研究中，实验人员克隆了PaWB thyA基因，参见申请号为2021202111429636.4的专利申请，但该酶在不同严重程度泡桐丛枝病样品中的植原体内的表达情况未知，植原体中胸苷酸合成酶的表达状况可为植原体增殖机理提供理论基础。

目前现有技术中，未见有泡桐丛枝植原体胸苷酸合成酶融合蛋白和泡桐丛枝植原体胸苷酸合成酶抗体的报道，该融合蛋白和抗体的制备可解决泡桐丛枝植原体或植原体胸苷酸合成酶的检测问题。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供泡桐丛枝植原体胸苷酸合成酶融合蛋白，该融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.4所示，分别简称为6×His/PaWB thyA-1融合蛋白和6×His/PaWB thyA-2融合蛋白，所述融合蛋白均为非包涵体蛋白。

泡桐丛枝植原体胸苷酸合成酶有两种蛋白，分别简称PaWB thyA-1蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)和PaWB thyA-2蛋白(氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)，这两种蛋白之间仅有1个氨基酸的差异。所述6×His/PaWB thyA-1融合蛋白为PaWB thyA-1基因ORF编码的PaWB thyA-1蛋白在N端融合了6×His标签肽段所得。所述6×His/PaWB thyA-2融合蛋白为PaWB thyA-2基因ORF编码的PaWB thyA-2蛋白在N端融合了6×His标签肽段所得。所述6×His标签肽段为初始载体pET-28a表达的34个氨基酸的肽段。

所述的PaWB thyA-1基因的ORF核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。所述的PaWB thyA-2基因的ORF核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示。

所述融合蛋白的制备方法包括以下步骤：

(1)将所述的泡桐丛枝植原体胸苷酸合成酶的基因重组于pET-28a载体的BamHI酶切位点和XhoI酶切位点之间，得到重组载体；用于构建重组载体的正向引物为thyAF-BamHI，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，反向引物为thyAR-XhoI，其核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示；