[发明专利]一种新抗原鉴定和疗效预测方法

权利要求书

1.一种新抗原鉴定和疗效预测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：取肿瘤组织和正常细胞开展全外显子测序和/或转录组测序和/或单细胞转录组测序，确定肿瘤组织异于正常细胞的非同义点突变和突变所在基因表达水平；取外周血或穿刺脾细胞或淋巴结或肿瘤组织浸润性淋巴细胞，使用人淋巴细胞分离液对外周血或穿刺脾细胞或淋巴结分离获得淋巴细胞，PBS缓冲溶液清洗后用无血清淋巴细胞培养基重悬置，37℃培养箱培养备用；

S2：以突变位点为中心，向前后各截取X个氨基酸序列，获得候选抗原序列，X为MHC分子类型最大可递呈的核心氨基酸数量；若突变位点距离起始密码子或终止密码子距离小于X个氨基酸时候，向前截取到起始密码子，向后截取到终止密码子；同时，获取候选抗原序列对应的未突变野生型序列；

S3：根据步骤S2中的获取得候选抗原序列，合成对应的抗原型多肽序列或抗原型mRNA序列或抗原型DNA序列；根据未突变野生型序列，合成野生型多肽序列或野生型mRNA序列或野生型DNA序列；

S4：将抗原型多肽序列或抗原型mRNA序列或抗原型DNA序列跟步骤S1中获得的淋巴细胞共同培养1-6天，为候选抗原组；将野生型多肽序列或野生型mRNA序列或野生型DNA序列跟步骤S1获得的淋巴细胞共培养1-6天，为野生型对照组；

S5：采用流式抗体标记淋巴细胞CD11b和/或CD83和/或MHC-II和/或CD62L和/或4-1BBL表达情况，候选抗原组中的CD11b和/或CD83和/或MHC-II和/或CD62L和/或4-1BBL表达情况为阳性的细胞数/细胞亚群比例/抗体所带荧光强度/基因表达水平高于野生型对照时，鉴定结果即为阳性，此该候选抗原组种的候选抗原即鉴定为新抗原；

或者通过Elisa和/或Elispot和/或流式细胞检测术检测野生型对照组和候选抗原组的培养上清的IL-1α细胞因子释放情况，若候选抗原组的IL-1α细胞因子的表达水平高于野生型组即为阳性，此候选抗原鉴定为新抗原；

S6：对步骤S5鉴定出的新抗原进行CD25和/或IL7Rα和/或CD44表达检测；新抗原同淋巴细胞共孵育后对比孵育前淋巴细胞，新抗原同淋巴细胞共孵育后的淋巴细胞的CD25和/或IL7Rα、和/或CD44阳性的细胞数/细胞亚群比例/抗体所带荧光强度/基因表达水平比孵育前淋巴细胞没有显著上调，预测步骤S5鉴定的新抗原疗效较好，反之预测为疗效较差；

或者，通过Elisa或Elispot或流式细胞检测术检测野生型组和新抗原组培养上清的IL12p70细胞因子释放情况，若IL12p70在新抗原组表达水平高于野生型组即为阳性，预测步骤S5鉴定的新抗原疗效较好，反之预测为疗效较差；

或者，对步骤S5中鉴定的新抗原的基因序列在肿瘤细胞中的表达和新抗原对应正常基因序列在正常细胞表达情况，若新抗原的基因序列在肿瘤细胞的mRNA或蛋白表达水平相较新抗原对应正常基因序列在正常细胞中的表达情况有升高，预测步骤S5鉴定的新抗原疗效较好，反之预测为疗效较差。

2.根据权利要求1所述的一种新抗原鉴定和疗效预测方法，其特征在于，在步骤S4中，还包括对抗原型多肽序列或抗原型mRNA序列或抗原型DNA序列、野生型多肽序列或野生型mRNA序列或野生型DNA序列进行电击一次，电击的工作电压150V，电击15ms。

3.根据权利要求1所述的一种新抗原鉴定和疗效预测方法，其特征在于，在步骤S6中，基因序列在细胞的mRNA表达水平采用转录组测序或RT-Real time PCR检测实现，基因序列在细胞的蛋白表达水平采用蛋白质谱或Western blot检测实现。

4.根据权利要求1所述的一种新抗原鉴定和疗效预测方法，其特征在于，用于对哺乳动物的癌症的新抗原进行鉴定和疗效预测，哺乳动物的癌症包括：B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、蕈样真菌病、霍奇金氏病、髓细胞性白血病、膀胱癌、脑癌、神经系统癌症、头颈癌、头颈部鳞状细胞癌、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、皮肤癌、黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、肝癌、口腔、咽喉、喉部和肺的鳞状细胞癌、宫颈癌、乳腺癌、肾癌、泌尿生殖系统癌症、肺癌、食管癌、头颈癌、大肠癌、造血系统癌症；睾丸癌；结直肠癌、前列腺癌、AIDS相关的淋巴瘤或AIDS相关的肉瘤的任意一种。