[发明专利]一种同时检测六种水稻病毒的试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种同时检测六种水稻病毒的试剂盒，其特征在于：包括：用于检测水稻锯齿叶矮缩病毒RRSV的引物组、用于检测水稻条纹病毒RSV的引物组、用于检测水稻矮缩病毒RDV的引物组、用于检测南方水稻黑条矮缩病毒SRBSDV的引物组、用于检测水稻黑条矮缩病毒RBSDV的引物组、用于检测水稻草状矮化病毒RGSV的引物组；

所述用于检测水稻锯齿叶矮缩病毒RRSV的引物组如下：

RRSV CP(p8)-F CGGAGAGAGATAACGCTTGG

RRSV CP(p8)-R CACAGTAATAACCGCACGCT；

所述用于检测水稻条纹病毒RSV的引物组如下：

RSV CP(pC3)-F GGCTGTGGACTCTTCTGACC

RSV CP(pC3)-R TTGTCAGACCACGCTCCTTC；

所述用于检测水稻矮缩病毒RDV的引物组如下：

RDV CP(p8)-F TGTATGAGCGCCAAAATGCG

RDV CP(p8)-R CCACCACCAAGTGAGAACGA；

所述用于检测南方水稻黑条矮缩病毒SRBSDV的引物组如下：

SRBSDV CP(p10)-F CACACTTCTGTCTCACTTCAACTCTCT

SRBSDV CP(p10)-R CTTACGCAACGATGAACCTTTCTCTAT；

所述用于检测水稻黑条矮缩病毒RBSDV的引物组如下：

RBSDV CP(p10)-F GAAGGAAACATTACTTTGAAGCCC

RBSDV CP(p10)-R CGCTCAACACTTCGCCAAT；

所述用于检测水稻草状矮化病毒RGSV的引物组如下：

RGSV CP(pC5)-F ATTGAGACCCATTAGTACCGTTG

RGSV CP(pC5)-R AGAGCAGTTTCCTGTAGTCCCCA。

2.根据权利要求1所述的同时检测六种水稻病毒的试剂盒，其特征在于：还包括：Onestep RT/Taq Mix、5×Reaction Buffer和DEPC-ddH₂O。

3.权利要求1所述的试剂盒在检测水稻病毒中的应用。

4.采用权利要求1所述的试剂盒检测水稻病毒的方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1，提取水稻叶片总RNA；

步骤2，以步骤1提取的水稻叶片总RNA为模板，采用权利要求1所述的试剂盒对其进行RT-PCR扩增；

步骤3，对步骤2的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；

结果判断标准如下：在100～250bp之间出现条带则存在水稻条纹病毒RSV；在250～500bp之间，接近250bp出现条带则存在水稻草状矮化病毒RGSV，接近500bp左右出现条带则存在水稻矮缩病毒RDV；在500～750bp之间出现条带则存在水稻锯齿叶矮缩病毒RRSV；靠近750bp出现条带则存在水稻黑条矮缩病毒；靠近1000bp出现条带则存在南方水稻黑条矮缩病毒SRBSDV。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤2中的RT-PCR扩增体系包括：OnestepRT/Taq Mix 0.75μL、5×Reaction Buffer 4μL，模板量为1μg，0.3μM RSV引物0.6μL，0.2μMRDV引物0.4μL，0.25μM RGSV引物0.3μL，0.2μM RRSV引物0.4μL，0.3μM RBSDV引物0.6μL，0.1μM SRBSDV引物0.2μL，DEPC-ddH₂O补足至20μL。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤2中RT-PCR扩增条件为：

反转录反应条件：50℃，30min；

RT-PCR反应条件：预变性，94℃，2min；变性，94℃，30s；退火，58℃，30s；延伸，72℃，1min；重复变性、退火和延伸30个循环；终延伸，72℃，10min。