[发明专利]一株黑曲霉基因工程菌及构建方法与应用

说明书

本发明公开了一株黑曲霉基因工程菌及构建方法与应用，所述重组黑曲霉基因工程菌为在出发菌中过表达铁获取调控基因AcuK，得到重组黑曲霉基因工程菌。本发明通过基因敲除手段构建了一株铁获取调控基因AcuK过表达的重组黑曲霉基因工程菌。该重组基因工程菌使黑曲霉在固定化发酵产柠檬酸过程中生物膜量增加的同时减轻载体抱团现象，发挥出固定化发酵的优势，提高了柠檬酸的产量，缩短了发酵周期。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株铁获取调控基因AcuK的黑曲霉基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

因柠檬酸的用途广泛，其在医药、食品、农业等产业都扮演重要的角色，每年都会消耗大量的柠檬酸。在有机酸的市场中，柠檬酸具有着高达70％的市场占有率。在食品工业，柠檬酸普遍用于生产各类饮料、糖果、饼干等食品，亦可作为调味剂或抗氧化剂来使用，柠檬酸盐也在食品工业中发挥重要作用；在医药行业，柠檬酸盐可帮助药物中有效成分的快速溶解，或作为抗血凝剂使用；在化工产业，柠檬酸被作为络合剂、掩蔽剂、助洗剂等被大量使用；在纺织业、畜牧业、环保等方面，柠檬酸也被广泛使用。在目前柠檬酸的工业生产中，使用黑曲霉生物发酵是最主要的途径之一，其主要原料是玉米等粮食作物。然而我国现今粮食储备尚不能满足国民需求，且粮食价格普遍上涨，柠檬酸的生产成本也随之升高，为此需要改进柠檬酸发酵方法，降低发酵成本。

基于固定化酶技术开发出的细胞固定化发酵技术可以使发酵连续不断进行，缩短生产周期并提高产量，极大提高柠檬酸发酵的效率的同时也降低了成本。目前细胞固定化方法主要有四种：包埋法、交联法、共价结合法以及吸附法。吸附法是基于细胞表面与载体表面的相互作用力，主要是疏水作用力和静电作用力来促进细胞在载体表面的吸附。对于丝状真菌来说，吸附法操作简单，固定过程中只有物理作用，不存在化学变化，理论上可用于所有丝状真菌的细胞固定，有利于工业化的大规模应用。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株重组黑曲霉基因工程菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述重组黑曲霉基因工程菌的构建方法。

本发明还要解决的技术问题是提供上述重组一种菌剂。

本发明进一步要解决的技术问题是提供上述重组黑曲霉基因工程菌和上述菌剂的应用。

本发明最后要解决的技术问题是提供一种产柠檬酸的方法。

为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一株重组黑曲霉基因工程菌，所述重组黑曲霉基因工程菌在出发菌中过表达铁获取调控基因AcuK。

其中，所述出发菌为黑曲霉Aspergillus Niger ATCC12846。

其中，所述过表达铁获取调控基因AcuK的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

其中，在出发菌中过表达铁获取调控基因AcuK的方法为向出发菌中导入过表达铁获取调控基因AcuK的质粒，使黑曲霉中的AcuK基因表达量增加，基因AcuK可以抑制黑曲霉中SreaA基因并且诱导HapX基因的表达，以此刺激还原铁同化，促进铁载体介导的铁吸收。过表达AcuK基因后，胞内铁离子水平的提高促进了疏水蛋白的形成，疏水作用力增强，使得孢子表面疏水性显著增强，生物膜形成增加，同时过表达的AcuK基因还改变了载体上吸附的生物膜的表型，使载体上生成的膜形成丝状结构，减轻了抱团现象，提高传质效率，从而影响固定化发酵和产柠檬酸的效果。

其中，所述过表达铁获取调控基因AcuK的质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

为了解决上述第二个技术问题，本发明公开上述重组黑曲霉基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)提取原始黑曲霉的基因组DNA；