[发明专利]一种固定化酶法生产L-鸟氨酸的方法

权利要求书

1.一种固定化酶法生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将人重组精氨酸酶I生产菌的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为32-34℃，pH为6.8-7.2，溶氧为20-40％，搅拌转速180-220rpm；发酵培养至发酵液稀释100倍后的OD₆₀₀值为0.50-0.60时，降温至22℃，向体系中加入IPTG，使IPTG在体系中的终浓度为0.2mmol/L，诱导培养20-28h；

培养过程中监测体系的甘油含量，当体系的甘油含量≤1.0g/L时开始添加补料，通过流加补料使体系中的甘油含量保持在0.5-1g/L；

(2)将步骤(1)诱导培养后的培养液的pH值调至7.1-7.3，进行破菌处理；将细胞破碎后的混合匀浆过陶瓷膜，收集滤液；将滤液稀释至滤液中人重组精氨酸酶I的浓度为8-12g/L，采用镍柱亲和层析，将稀释后的滤液进行挂柱；

(3)将含有L-精氨酸的底物溶液流经步骤(2)挂柱后的镍柱进行生物转化，收集流出的转化液，即生产得到L-鸟氨酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述人重组精氨酸酶I生产菌由如下方法构建而成：

将pHT304质粒用NdeⅠ和HincⅡ双酶切处理，将SEQ ID NO.1所示的Pg3启动子序列整合到双酶切处理后的pHT304质粒上，得到质粒pHT304-Pg3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；再用SphⅠ和SacⅠ对质粒pHT304-Pg3进行双酶切处理，将arg1基因整合到双酶切处理后的质粒pHT304-Pg3上，获得重组表达载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

将获得的重组表达载体导入到枯草芽孢杆菌中，构建得到人重组精氨酸酶I生产菌。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，arg1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，发酵培养基的组成为：蛋白胨12g/L、甘油10g/L、酵母膏8g/L、氯化钠3g/L、硫酸铵2.5g/L、三水磷酸氢二钾4g/L、柠檬酸铁铵0.3g/L、柠檬酸2.1g/L、七水硫酸镁0.5g/L、氨苄青霉素100ppm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述补料中含有甘油400g/L、蛋白胨30g/L、酵母膏100g/L。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，镍柱亲和层析的条件为：以50mM的PBS作为结合缓冲液，将滤液挂柱。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述底物溶液中含有：L-精氨酸50g/L，磷酸吡哆醛1mg/L，二甲基亚砜0.1mg/L。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，底物溶液的流速为3m³/h。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，生物转化的条件为：转化温度25℃-45℃，pH7.2-7.3。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，生物转化的条件为：转化温度37℃，pH7.25。