[发明专利]一种利用DNA探针分离球虫小配子的方法

说明书

本发明提供了一种利用DNA探针分离球虫小配子的方法，属于生物技术领域。本发明提供了一种利用DNA探针分离球虫小配子的方法，从感染球虫卵囊的动物盲肠中分离盲肠黏膜组织，去除杂质，得到球虫细胞；用DNA探针对所述球虫细胞进行染色，将染色后的球虫细胞用流式细胞仪分选，去除死细胞和杂质，收集单倍体细胞为球虫小配子。本发明提供的方法为研究球虫小配子的蛋白质组学和转录组学以及在药物研发中的应用奠定了基础。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用DNA探针分离球虫小配子的方法。

背景技术

细胞周期是从细胞分裂产生的新细胞生长开始到下一次细胞分裂形成子细胞结束为止所经历的过程，主要分为G0期、G1期、S期、G2期和M期。G0期细胞是指处于相对静时期的细胞，细胞暂时不参与细胞的增殖而执行一定的生物学功能，所以细胞是二倍体；G1期为DNA合成前期的，此时细胞为下一次有丝分裂准备DNA合成所需要的各种物种和能量等，细胞仍为二倍体；S期即DNA合成期，此期是细胞周期中的关键时期，DNA的量经过复制增加一倍，S细胞内的DNA处于从二倍体量到四倍体量的连续增加过程；G2期即DNA合成后期，此时DNA合成已经完成，为下一步有丝分裂做准备，细胞为四倍体；M期即细胞分裂期(mitosis)，在分裂完成前细胞仍为四倍体。而M期又可以进一步分为前期(prophase)、中期(metaphase)、后期(anaphase)和末期(telophase)。处于G0和G1期的细胞含有二倍体量的DNA，处于S期的细胞含有从二倍体量至四倍体量的DNA，处于G2和M期的细胞含四倍体量的DNA。所以利用非特异性核酸荧光染料与细胞内的DNA结合，通过流式检测就能反映细胞内DNA的含量，区分细胞周期的G0/1期、S期和G2/M期。

早在20世纪初，Dobell和Jameson(1915)就对球虫的核分裂问题进行研究，合子的第一次分裂是减数分裂，球虫生活史过程中其他阶段主要是单倍体型虫体(Canning和Anwar，1968)。1975年，Canning等用显微密度分析法对艾美尔球虫DNA含量进行测定，证实了早期的研究结果。其后Cornelisen等在对艾美尔亚目某些种球虫(包括柔嫩艾美尔球虫和刚地弓形虫等)核DNA的初步研究中(Colnelisso等，1984)，用孚尔根-碱性品红对上述虫种不同阶段染色后观察核DNA的荧光发射，证实在柔嫩艾美尔球虫的子孢子、裂殖体、裂殖子、小配子体和大配子体等阶段虫体都能发出典型的亮红色荧光。随后，他们又用直接显微荧光分析法(测量用紫外光激发孚尔根-碱性品红试剂染色的单个细胞发射的荧光总值)和用孚尔根-碱性品红试剂染色核荧光发射或同一孚尔根-碱性品红试剂染色吸收照相产生的显微照相底片扫描技术测定了上述几阶段虫体的DNA含量，证实柔嫩艾美尔球虫子孢子、第二代裂殖子和小配子的DNA含量基本接近，但对大配子未做检测。

配子的生成是一个的十分复杂但又高度有序的细胞分化过程，柔嫩艾美尔球虫分裂时，一部分裂殖体形成大配子体(雌性)，一部分形成小配子体(雄性)，配子发育成熟后，形成大小配子，大配子与小配子结合形成合子。配子体阶段容易混杂有大配子母细胞、小配子母细胞、大配子和小配子虫体，有些发育较早的情况甚至会出现合子。其中大配子、大配子母细胞、小配子母细胞等颗粒度较大，体积也较大；而小配子的颗粒度较小，体积较小；且在柔嫩艾美尔球虫虫体发育的各个阶段，大配子的DNA含量可能与小配子等阶段存在差异，可以根据DNA含量的差异区分大配子和小配子。然而目前尚缺乏有效的柔嫩艾美尔球虫小配子分离方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种利用DNA探针分离球虫小配子的方法，具有分离准确性高、快速的特点。

本发明提供了一种利用DNA探针分离球虫小配子的方法，包括以下步骤：

从感染球虫卵囊的动物盲肠中分离盲肠黏膜组织，去除杂质，得到球虫细胞；

用DNA探针对所述球虫细胞进行染色，得到染色后的球虫细胞；