[发明专利]一种利用DNA探针分离球虫小配子的方法

权利要求书

1.一种利用DNA探针分离球虫小配子的方法，其特征在于，包括以下步骤：

从感染球虫卵囊的动物盲肠中分离盲肠黏膜组织，去除杂质，得到球虫细胞；

用DNA探针对所述球虫细胞进行染色，得到染色后的球虫细胞；

将染色后的球虫细胞用流式细胞仪分选，依照细胞大小和细胞的颗粒度进行初步圈门，获得含有球虫大配子和球虫小配子的细胞群；

对所述含有球虫大配子和球虫小配子的细胞群经倍性分析，根据倍性分布情况，分别对单倍体细胞和二倍体细胞进行圈门，得到单倍体细胞群和二倍体细胞群；

合并单倍体细胞群，得到球虫小配子。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述DNA探针包括Hochest33342或Hochest33258。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述去除杂质的方法包括将盲肠黏膜组织经消化、分子滤筛过滤，所得滤液用滤膜过滤后，收集未滤过部分洗涤和纯化，收集纯化后细胞为球虫细胞。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述消化用酶为透明质酸酶；

所述消化的条件为：温度为40～42℃，消化时间为1～2h，透明质酸酶的工作浓度为0.4～0.6mg/mL；

所述消化的溶剂为SAC液；所述SAC液包含以下含量组分：170mmol/L氯化钠溶液、10mmol/LTris Base、5mmol/L葡萄糖溶液、5mmol/L氯化钙溶液、1mmol/LPMSF，1mg/mLBSA，调节pH值至7.0。

5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述分子滤筛过滤包括多级分子滤筛过滤；所述多级分子滤筛的孔径优选包括50～80目、250～270目。

6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述滤膜过滤包括2种以上不同孔径的滤膜过滤；

滤膜的孔径包括15～20μm和4～6μm。

7.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述纯化依次用体积浓度为30％和50％的Percoll溶液进行。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，初步圈门的方法包括设门；所述设门是在流式细胞图以FSC为横坐标，SSC为纵坐标，排除对角线区域靠近原点部位的细胞来去除死细胞，圈出对角线中间较为密集的细胞群得到含有球虫大配子和球虫小配子的细胞群；

单倍体细胞群的验证方法采用光学显微镜选择。

9.根据权利要求1～8任意一项所述方法，其特征在于，所述球虫包括以下球虫中的一种或几种：柔嫩艾美尔球虫、毒害艾美尔球虫、巨型艾美尔球虫、堆型艾美尔球虫、缓艾美尔球虫、布氏艾美尔球虫、早熟艾美尔球虫和刚地弓形虫。

10.权利要求1～9任意一项所述方法分离得到的球虫小配子在研究小配子的蛋白质组和转录组学或药物研发中的应用。