[发明专利]脱氨酶介导的DNA中N4

说明书

本发明公开了一种脱氨酶介导的DNA中N⁴‑甲基胞嘧啶的单碱基分辨率定位分析方法，属于生物技术领域。本发明方法利用胞嘧啶脱氨酶A3A蛋白对DNA中正常的胞嘧啶和5‑甲基胞嘧啶进行脱氨基，随后在后续聚合酶链式反应扩增形成胸腺嘧啶，而目标分析物N⁴‑甲基胞嘧啶能够抵抗胞嘧啶脱氨酶A3A的脱氨作用，因此在随后的聚合酶链式反应中扩增为胞嘧啶。这样，只有N⁴‑甲基胞嘧啶修饰才能在最终的测序中被读为胞嘧啶。本发明方法选择性高，准确性好，无需对DNA样品进行亚硫酸氢盐的处理，可直接获得DNA中N⁴‑甲基胞嘧啶的单碱基分辨率图谱。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种脱氨酶介导的DNA中N⁴-甲基胞嘧啶的单碱基分辨率定位分析方法。

背景技术

N⁴-甲基胞嘧啶(4mC)是一种DNA甲基化修饰，主要存在于极度嗜热菌和部分嗜常温菌DNA中，在真核生物特别是哺乳动物中目前还没有报道。迄今为止，已经发现了多种细菌DNA的4mC甲基转移酶，这些甲基转移酶能够与限制性内切酶结合形成序列特异性限制-修饰系统。宿主DNA中的4mC碱基在识别特定基序的限制性内切酶和保护宿主基因组方面起着非常重要的作用。尽管4mC能够通过液相色谱、液相色谱串联质谱(LC-MS)等技术高灵敏地被检测和定量，但它们在基因组DNA中的定位信息一直是一个挑战。建立4mC的测序技术有助于对其生物学功能进行更加深入的研究。

目前对于DNA中4mC的单碱基分辨率测序方法有两类，一种是基于传统亚硫酸氢盐测序的分析方法，另一种为单分子实时测序(SMRT)方法。亚硫酸氢盐测序是一种广泛使用的DNA中5-甲基胞嘧啶(5mC)单碱基分辨率测序方法，由于5mC对亚硫酸氢盐转化具有严格的抗性，而且5mC广泛分布于各物种基因组中，因此标准亚硫酸氢盐测序并不适用于区分5mC和4mC。基于此，有人开发了一种4mC-Tet辅助的亚硫酸氢盐测序(4mC-TAB-seq) 方法。在4mC-TAB-seq方法中，5mC被Tet蛋白氧化为5-羧基胞嘧啶，后者经亚硫酸氢盐处理后脱氨，并在测序中读作胸腺嘧啶。在4mC-TAB-seq方法中，胞嘧啶和5mC都被测序读为胸腺嘧啶，而只有4mC位点被解读为胞嘧啶，因此，实现了对整个基因组中4mC的特异性检测。然而，基于亚硫酸氢盐的策略需要苛刻的化学脱氨条件，从而导致高达99.9％的DNA 被降解。与二代测序方法不同的是，SMRT技术能够以单核苷酸分辨率直接检测修饰碱基，并已被用于DNA中4mC的检测。然而，与常用的二代测序技术相比，SMRT测序成本更高， DNA用量更大，测序错误率相对较高。

人载脂蛋白B mRNA编辑催化亚基3A(A3A)家族酶的成员能够在单链DNA中将胞嘧啶转化为尿嘧啶，并在病毒感染和癌症发生中具有非常关键的功能。研究表明，A3A对DNA中的胞嘧啶和5mC具有高效的脱氨活性，且两种胞嘧啶衍生物5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)和 5-醛基胞嘧啶(5fC)都可以被高效脱氨。A3A的脱氨活性不依赖于序列特异性，因此能够对全基因组上所有胞嘧啶进行脱氨基。在此基础上，有研究开发了用于5hmC测序的A3A辅助的定位分析方法，即ACE-seq和AMD-seq。目前，还没有不依赖于亚硫酸氢盐处理、高选择性、操作简单的4mC定位分析方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胞嘧啶脱氨酶介导的DNA中N⁴-甲基胞嘧啶(4mC)单碱基分辨率定位分析方法，即一种不依赖于亚硫酸氢盐处理、高选择性、操作简单的4mC定位分析方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种脱氨酶介导的DNA中N⁴-甲基胞嘧啶的单碱基分辨率定位分析方法，包括如下步骤：

(1)对待检DNA进行变性处理。

(2)经变性处理的DNA用胞嘧啶脱氨酶进行脱氨处理。

(3)脱氨后的DNA样品进行PCR扩增。