[发明专利]检测人间充质干细胞影响T细胞增殖活性试剂盒及方法

说明书

本发明涉及检测人间充质干细胞影响T细胞增殖活性试剂盒及方法，属于细胞增殖检测技术领域。本发明提供了检测人间充质干细胞影响T细胞增殖活性的试剂盒，所述试剂盒包括：整合了荧光素酶基因的T淋巴细胞、荧光底物和人间充质干细胞。本发明所述试剂盒能够更加敏感的测出MSC细胞对T细胞的增殖活性影响。

技术领域

本发明涉及细胞增殖检测技术领域，具体涉及检测人间充质干细胞影响T细胞增殖活性的试剂盒及方法。

背景技术

人间充质干细胞(human mesenchymal stem cells，hMSCs)是一类贴壁培养后呈成纤维细胞样形态(纺锤形和梭形)、可在体外自我更新并具有成骨、成脂、成软骨等分化能力的干细胞。人间充质干细胞可由多种人体组织(如骨髓、脐带、胎盘、脂肪等)分离得到，也可以通过分化或转分化等方式获得；不同来源的人间充质干细胞在基因表达和分化能力方面存在差异。MSCs主要在抗炎、调节免疫等方面起着重要作用。随着对MSCs的理解越来越深入，其成药性的可能也大大增加。

MSC的质量控制涉及到细胞形态、染色体核型、细胞活率、细胞表面标志物、成瘤性、三系分化能力、免疫调节能力及微生物检测等。其中，免疫调节能力检测包括：经炎症因子(IFN-γ或者IFN-γ联合TNF-α)诱导后表达吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)；与T淋巴细胞共培养，能抑制T淋巴细胞增殖及分泌IFN-γ、TNF-α。涉及T淋巴细胞增殖检测的实验主要有CCK-8方法，但由于T淋巴细胞和MSC细胞数量都可以用CCK8检测到，因此检测不够敏感，并结果会受MSC细胞增殖等生物学因素影响。

发明内容

本发明的目的在于提供检测人间充质干细胞影响T细胞增殖活性试剂盒及方法。本发明所述试剂盒能够更加敏感的测出MSC细胞对T细胞的增殖抑制活性。

本发明提供了检测人间充质干细胞影响T细胞增殖活性的试剂盒，所述试剂盒包括：整合了荧光素酶基因的T淋巴细胞、荧光底物和人间充质干细胞。

优选的是，所述荧光素酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的是，所述试剂盒还包括整合了荧光素酶基因的T淋巴细胞的培养基和人间充质干细胞培养基。

优选的是，所述试剂盒还包括酶标板。

本发明还提供了一种检测人间充质干细胞抑制T细胞增殖能力的方法，包括以下步骤：

制备携带荧光素酶基因的慢病毒，将所述携带荧光素酶基因的慢病毒感染T淋巴细胞，得到整合了荧光素酶基因的T淋巴细胞；

将整合了荧光素酶基因的T淋巴细胞与人间充质干细胞共培养，加入荧光底物，测定荧光值，计算人间充质干细胞对T淋巴细胞的抑制率。

优选的是，所述慢病毒包括携带荧光素酶基因的Lenti-EF1a-luciferase-puro慢病毒载体。

优选的是，所述慢病毒中还含有PGK启动子和嘌呤霉素抗性基因。

优选的是，所述整合了荧光素酶基因的T淋巴细胞与人间充质干细胞共培养的数量比为(1～10)：1。

优选的是，所述共培养包括：培养人间充质干细胞贴壁并增殖至55～65％，加入整合了荧光素酶基因的T淋巴细胞共培养96h。

优选的是，按照以下公式计算人间充质干细胞对T淋巴细胞的抑制率：抑制率＝[(C-A)-(D-B)]/(C-A)×100％；其中，A为整合了荧光素酶基因的T淋巴细胞的培养基组的荧光值平均值，B为人间充质干细胞组的荧光值平均值，C为整合了荧光素酶基因的T淋巴细胞组的荧光值平均值，D为整合了荧光素酶基因的T淋巴细胞与人间充质干细胞共培养组的荧光值平均值。