[发明专利]新型转座子突变株文库的构建系统、新型转座子突变文库和应用

说明书

本发明公开了一种新型转座子突变文库的构建系统，可通过化学转化和电转化法把质粒转进目的菌株中，然后诱导转座酶的表达，只需一个含有转座子的突变株，就能得到几乎覆盖全基因组范围内的转座子突变文库。这种新型转座子文库的构建系统不仅可以增大转座突变的多样性，更有助于菌株插入位置的确定，有助于研究铜绿假单胞菌的基因组注释、功能分析及其耐药机制的研究。

技术领域

本发明属于基因突变技术领域，尤其是一种新型转座子突变株文库的构建系统、新型转座子突变文库和应用。

背景技术

转座子(Tn)，亦称跳跃基因，是指能将自身基因插入基因组中任何一个基因序列中一组基因元件，分为复合转座子和复杂转座子。抗性转座子的本质是一种在元素内结合抗性基因的跳跃基因系统。比较著名的转座子是Tn5，它能编码抗氨基糖苷类抗生素如卡那霉素、新霉素的基因；在一些革兰氏阴性细菌中，特别是在肠杆菌科中发现Tn10转座子能编码抗四环素的基因。

插入序列(Insertion sequence,IS)是在细菌中发现的一类最简单的转移元件，一般大小在600～2000bp；插入序列只编码转座酶，插入序列是最为简单的转座子，位于两个插入序列之间的基因序列也可随插入序列转移；细菌转座子、喹诺酮作用靶位保护蛋白基因、插入序列可携带β-内酰胺酶基因、16S rRNA甲基化酶基因、氨基糖苷类修饰酶基因、外排泵基因。另外通过分子重构也能够获得高活性的人工转座子，如SleepingBeauty,SB。SB和Mos1等转座子作为基因转移载体已被广泛应用于转基因、基因捕获和基因治疗等领域的研究中，并取得了很好的应用效果。

本研究前期发现插入序列ISRP10阻断铜绿假单胞菌oprD基因，导致细菌对亚胺培南产生耐药性(Qinghui Sun,et.al.,Insertion sequence ISRP10 inactivation oftheoprD gene inimipenem-resistant Pseudomonas aeruginosa clinical isolates[J].International Journal of AntimicrobialAgents.2016,5(47):375-379.)，并且对其阳性率的检测发现该插入序列阳性率为32.8％。通过分析ISRP10属于IS30家族，长度为1115-1117bp，G+C含量为60.22％。该插入序列ISRP10中的第174-327位氨基酸编码整合酶，该整合酶具有核酸酶活性、核酸外切酶活性、水解酶活性、DNA重组功能、DNA转移功能。该催化域中还存在两个金属活性中心位置分别为184aa和241aa，且都为镁离子活性中心，如图1所示。

铜绿假单胞菌是临床上重要的病原菌，该菌不仅能够对多种抗菌药物表现出天然耐药，还可以经抗生素诱导获得耐药性，且随着抗菌药物的广泛应用使其耐药性更加严重，这使临床上治疗铜绿假单胞菌的感染变得十分困难。铜绿假单胞菌产生耐药的机制非常复杂，目前为了研究其耐药机制可以利用转座子进行研究，但是当前转座子文库系统一般采用接合转移的方式进行构建，但以此方法构建出来的转座子文库存在效率偏低，操作繁琐且文库容量小等缺点。

为解决当前文库构建时存在的问题，使得转座子使用更加广泛，本发明提供了一种新型转座子突变文库的构建系统，可通过化学转化和电转化法把质粒转进目的菌株中，然后诱导转座酶的表达，只需一个含有转座子的突变株，就能得到几乎覆盖全基因组范围内的转座子突变文库。这种新型转座子文库的构建系统不仅可以增大转座突变的多样性，更有助于菌株插入位置的确定，有助于研究铜绿假单胞菌的基因组注释、功能分析及其耐药机制的研究。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术上存在的问题，提供一种新型转座子突变株文库的构建系统、新型转座子突变文库和应用。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：

一种新型转座子突变株文库的构建系统，构建步骤如下：