[发明专利]一种人冠状病毒HCoV-NL63的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种人冠状病毒HCoV‑NL63的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用，所述MNP标记位点包括参考基因组NC_005831.2的15个标记，所述引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.30所示。所述MNP标记位点能特异的鉴定人冠状病毒HCoV‑NL63；所述引物互不干扰，综合多重扩增和测序技术，可一次性对多样本的所有标记位点进行序列分析，具有高通量、多靶点、高灵敏、高精准和免培养的检测优势，可应用于大规模样本的人冠状病毒HCoV‑NL63的鉴定和遗传变异检测，对人冠状病毒HCoV‑NL63的科研和防疫监测均具有重要意义。

技术领域

本发明实施例涉及生物技术领域，特别涉及一种人冠状病毒HCoV-NL63的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用。

背景技术

冠状病毒在系统分类上属冠状病毒属(Coronavirus)，基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。病毒有包膜，电子显微镜观察这些包膜上有形状类似日冕的棘突，故命名这类病毒为冠状病毒。冠状病毒通过呼吸道分泌物排出体外，经口液、喷嚏、接触传染，并通过空气飞沫传播。冠状病毒感染分布在全世界多个地区，并多次引起大流行。2019爆发的新冠病毒感染的病原菌新型冠状病毒(2019-nCoV或SARS-CoV-2，引发新型冠状病毒感染COVID-19)是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV(引发重症急性呼吸综合征)和MERS-CoV(引发中东呼吸综合征)。通常HCoV-NL63感染引发的症状较轻，但易与其他呼吸道病毒合并感染，主要通过呼吸道飞沫和人与人接触传播。其通常在冬季末感染流行，潜伏期范围2-5d，主要感染婴幼儿及免疫功能低下或具有基础病的成人，症状包括发烧、咳嗽和肺炎等。

现有的人冠状病毒检测技术主要通过病毒的分离鉴定，依赖于检测病原和抗体进行血清型鉴定、间接或直接免疫荧光法和检测遗传物质的分子检测技术，包括PCR、核苷酸杂交和测序技术。这些技术各有优势，但在时长、操作复杂度、检测通量、检测变异的准确性和灵敏度、成本等方面也存在一个或多个局限。比如病毒分离鉴定操作复杂、耗时长；血清型鉴定、间接或直接免疫荧光法容易出现交叉反应，导致检测不准确，且不能监测变异；PCR检测技术一次反应仅针对一种病毒的1到2个标记进行检测，效率低下，且容易由于病毒的变异导致检测失败。宏基因组测序技术是另一种检测人冠状病毒的技术，但其往往包括大量的宿主测序数据，对低病毒载量的样本进行检测时，尤其需要超深度的测序，导致高的成本。因此，开发快速、准确的、一次性高通量的检测分型多种人冠状病毒的人冠状病毒检测分析方法对于人冠状病毒的检测和防疫都具有重要意义。

因此，开发快速、准确的、一次性高通量的检测分型多种人冠状病毒的人冠状病毒检测分析方法对于人冠状病毒的检测和防疫都具有重要意义。

发明内容

本发明目的是提供一种人冠状病毒HCoV-NL63的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用，可以对人冠状病毒HCoV-NL63进行鉴定和变异检测，具有多靶标、高通量、高灵敏和精细分型的效果。

在本发明的第一方面，提供了一种人冠状病毒HCoV-NL63的MNP标记位点，所述MNP标记位点是指在人冠状病毒HCoV-NL63基因组上筛选的物种特异的且在物种内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括人冠状病毒HCoV-NL63参考基因组NC_005831.2上的15个标记。

说明书表1对其进行了进一步的说明，表1中标注的所述MNP标记的起始和终止位置是基于表1中MNP同一行对应的参考序列确定的。

在本发明的第二方面，提供了一种用于检测所述MNP标记位点的多重PCR引物组合物，所述多重PCR引物组合物包括15对引物，每个MNP标记的引物包括上引物和下引物，具体的引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.30所示。说明书表1对其进行了进一步的说明。