[发明专利]一种检测NRAS基因突变的引物和探针、试剂盒及检测方法

说明书

本申请实施例属于NRAS基因突变检测技术领域，涉及一种检测NRAS基因突变的引物和探针，引物包括G12D突变引物、Q61K突变引物、Q61R突变引物和内控引物，探针包括G12D突变检测探针、Q61K突变检测探针、Q61R突变检测探针和内控检测探针，分别针对NRAS基因G12D突变和NRAS基因Q61K突变、Q61R突变进行检测。本申请还涉及一种检测NRAS基因突变的试剂盒和检测方法。本申请提供的技术方案能够简化操作过程，降低研究成本和技术复杂性，缩短检测时间，同时提高特异性以及检测灵敏度。

技术领域

本申请涉及神经母细胞大鼠肉瘤病毒基因同源体(NRAS基因)突变检测技术领域，更具体地，涉及一种检测NRAS基因突变的引物和探针、试剂盒及检测方法。

背景技术

神经母细胞大鼠肉瘤病毒基因同源体(NRAS基因)是RAS基因家族的一员。RAS基因家族包括KRAS、NRAS、HRAS，是EGFR(Epidermal growth factor receptor，表皮生长因子受体)的下游信号通路RAS-RAF-MAPK的关键基因，调节细胞的增殖、分化、凋亡、转移等生理过程。

结直肠癌是常见的消化道肿瘤之一。在全球范围内，结直肠癌的发病率、病死率位于常见肿瘤的前列。随着精准医疗的发展，表皮生长因子受体抑制剂(EGFRI)如西妥昔单抗逐渐成为结直肠癌一线用药。西妥昔单抗等EGFRI通过抑制EGFR基因的信号的发生，从而抑制肿瘤细胞的增值。研究表明，西妥昔单抗的疗效受RAS基因的状态影响。一个突变的RAS基因会持续激活RAS-RAF-MAPK信号通路，导致EGFRI抑制细胞生长的效果下降。研究表明，只有RAS基因野生型患者能从西妥昔单抗等EGFRI治疗中获益。2020年版《中国结直肠癌诊疗规范》中推荐在对结直肠癌患者使用西妥昔单抗等EGFRI治疗前，对患者的癌组织RAS基因的突变状态进行鉴定，并只对RAS基因野生型患者用药。因此，判别NRAS基因的突变状态有助于指导西妥昔单抗等EGFRI的使用，为临床用药提供理论参考。

目前，检测NRAS基因突变的方法主要有可逆末端终止测序法和荧光PCR法。

扩增阻碍突变系统(amplification refractory mutation system，ARMS)是PCR技术应用的发展，也称等位基因特性PCR(allele-specific PCR，AS-PCR)，是一种检测已知单碱基突变的方法。其基本原理是根据靶突变的碱基变化设计引物，这些引物包括一条共用的下游引物和一条特异性上游引物(反之亦可)。共用引物按常规方法进行设计，特异性引物则需根据靶突变的碱基变化进行设置，该引物的3’端的第一个碱基应为发生突变的碱基，且与靶突变型匹配。另外，在特异引物的3’端的第2～4位碱基引入错配碱基可增强该引物的特异性。在扩增时，如果不存在目的突变的序列，则该引物的3’端碱基不能结合并延伸，导致PCR不能发生，随后通过琼脂糖凝胶电泳或其他PCR反应标志物检测是否有目的PCR的产生，从而检测样本中靶突变是否存在。通过该方法，研究人员可以根据临床检测的需求，把检测不同突变的引物组放在不同的PCR反应中实现不同突变的检测；也可以把检测不同突变的引物组放在同一个PCR反应中实现多个突变的联合检测。