[发明专利]一种微量样本中利用ITS高通量测序技术检测真菌种类的方法

说明书

本发明涉及一种微量样本中利用ITS高通量测序技术检测真菌种类的方法，所述方法，包括以下步骤：步骤1，样本初处理；步骤2，真菌细胞裂解；步骤3，样本中游离核酸的去除；步骤4，ITS区的PCR扩增；步骤5，ITS测序建库和测序；步骤6，生物信息学分析。

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，涉及一种在极微量样本中，不经过提取核酸直接进行真菌的高通量快速检测的方法。

背景技术：

真菌种类繁多，广泛存在环境中是与人类关系非常密切的一类微生物。真菌也是人类重要的传染病病原，随着人口老龄化，广谱抗菌素、抗肿瘤药、免疫抑制剂的大量应用，放射治疗和器官移植的广泛进行，导管和插管的普遍开展，以及免疫缺陷患者尤其是艾滋病患者的急速增加，致使真菌感染特别是深部真菌感染大幅度上升。深部真菌感染现已成为艾滋病和肿瘤等重大疾病死亡的主要原因之一。另外，近年来一些高致病真菌和多耐药变异真菌菌株的出现，也引发社会和公众对真菌在引发突发公共卫生事件可能的担忧。

目前对临床真菌感染的主要技术仍然很薄弱，传统的镜检和分离培养仍然是真菌检测和真菌感染诊断的金标准。这些技术存在阳性率低和耗时长等缺陷。近年来，针对常见真菌感染各种PCR或RT-PCR定量或定性分析技术逐渐建立，并且在临床检测和诊断中应用，但这些技术需要序列特异性的引物才能进行真菌核酸的检测。因此，目前现有的真菌检测技术远不能满足新发或流行的传染性真菌感染早期检测，变异特征和传播途径确定的需要。

随着高通量二代测序技术(Next generation sequence,NGS)的迅速发展，测序成本也迅速降低，而测序质量和深度都大大提升。NGS已经应用于细菌和病毒的检测，并且在人类微生物组学研究中大量应用。NGS可以高效检测样本中存在的所有病毒和细菌进行检测。这一方法对于检测和分析一些未知病原体尤其具有重要意义。但是NGS用于临床样本中真菌感染以及临床样本中真菌的种类的检测仍然很困难。本发明的主要目的是建立一种在包括临床样本等微量样本中，不经过分离培养，利用NGS快速有效的真菌检测方法。

本发明人了解到，NGS在临床样本中真菌检测应用困难，究其原因最主要有几个方面，首先是临床样本中即使是真菌感染的样本，真菌的含量也很低，由于真菌存在细胞壁，临床样本总量限制下，很难用常规的提取方法获得足够用于检测的核酸。而且由于一些临床样本总体量比较少，更加无法获得足够的核酸对临床样本中真菌的存在数量，种类有效检测和分析。尤其在临床样本获取困难，或者微量样本，经过核酸提取会使得本来就占比例很小的真菌核酸进一步损失，造成微量样本中低丰度的真菌病原难于检出。

ITS序列是内源转录间隔区(Internally Transcribed Spacer)，位于真菌18S、5.8S和28S rRNA基因之间，分别命名为ITS 1和ITS 2。ITS序列片段较小(ITS 1和ITS 2长度分别为350bp和400bp)，易于分析，并且相对于在rRNA基因具有较高的保守性，而ITS在进化过程中能够容忍更多的变异，在绝大多数真核生物中表现出极为广泛的序列多态性。同时，ITS的保守型表现为种内相对一致，种间差异较明显，能够方便应用于种属间，甚至菌株间的差异的检测。目前已被广泛用于真菌不同种属的系统发育分析，对酵母类真菌和丝状真菌都具有高敏感性和特异性。目前很多研究者将ITS高通量测序应用临床感染真菌样本的真菌种类检测。Illumina公司也推出了利用ITS区域PCR扩增进行样本中真菌种类分析的测序方案。但是这些方案都需要提取样本核酸，无法满足极微量样本中真菌种类的检测要求。

现有的检测方法都需提取核酸，通过PCR扩增ITS区，然后建库进行高通量测序检测。因为提取过程中会有核酸损失，对于极微量或者难于获得足量纯核酸作为模板用于ITS区PCR扩增的样本，则难以检测。本发明的目的在于提供一种用于利用高通量测序技术对极微量临床样本中真菌或者样本中真菌丰度极低不适合进行核酸提取的样本，不经过分离培养，和核酸提取，直接进行真菌细胞裂解，利用ITS测序技术进行高通量检测。