[发明专利]羊毛固定化酶的制备方法及羊毛固定化酶柱反应器

说明书

本发明公开了羊毛固定化酶的制备方法及羊毛固定化酶柱反应器，属于固定化酶技术领域。羊毛是一种天然的柔性材料，其中角蛋白含量占据羊毛的80％以上，经过处理和表面修饰后的羊毛会暴露出许多有效的功能化基团，比如端氨基、端羧基和巯基等，且具有较好的生物相容性和机械强度，有利于酶的固定化。柱反应器在分析和生产中应用广泛，有着优异的传质性能，制备方法简单且可以重复利用，适合多种组分的分离纯化以及工业生产应用。本发明所得的羊毛固定化酶及羊毛固定化酶柱反应器有较好的催化能力和稳定性。本发明的优点在于工艺简单、制备条件温和、便于连续化生产。

技术领域

本发明涉及固定化氧化还原酶的方法，属于酶固定化领域。

背景技术

氧化还原酶是一类能催化两分子间发生氧化还原作用的酶的总称，包括多种重要的酶类。其中，氨基酸脱氢酶(AaDH)可催化可逆的氨基酸氧化脱氨和酮酸还原胺化反应。对于非天然底物的还原胺化反应，选择底物2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(EOPB)在含铵盐体系中(提供NH₄⁺受体)进行还原胺化高选择性生成L-高苯丙氨酸(LHPA)。利用AaDH可合成非天然氨基酸L-高苯丙氨酸(LHPA)，以便更广泛地应用在药物、新型生物材料和化妆品等领域。

由于游离的脱氢酶稳定性差，采用固定化的方法可进行改善。固定化酶的性能取决于固定化酶所使用的载体材料的性质和固定化方法。目前的氨基酸脱氢酶等氧化还原酶的固定技术，还存在固定化酶稳定性差，重复利用活性低等问题，更重要的是固定化酶应用在连续性反应器中比较少。因此，还有必要对固定化方法和在连续性反应器中的应用进行进一步研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了羊毛固定化酶的制备方法及羊毛固定化酶柱反应器。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：

一种羊毛固定化酶的制备方法，采用尿素/硫化钠/十二烷基硫酸钠工艺对羊毛进行表面处理，处理温度为25～65℃，反应时间不超过3h，得到表面修饰后的羊毛；将表面修饰后的羊毛浸入到氧化还原酶溶液中充分混匀结合，所述氧化还原酶的终浓度为0.1～100mg/mL，0～50℃混匀后，加入化学交联剂使其体积分数为2～3％进行交联共价或者加入金属离子并使其终浓度为0.8～40mM进行配位，所述的化学交联剂包括1-乙基-3-(3-二甲基丙基)碳化亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或戊二醛(GA)中的至少一种，所述金属离子包括Mg²⁺、Zn²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺或Cu²⁺中的至少一种，进行交联或者配位10～100min，即得羊毛固定化氧化还原酶。

进一步地，氧化还原酶均可采用此方法，所述氧化还原酶例如包括氨基酸脱氢酶、胺脱氢酶、苹果酸脱氢酶等脱氢酶。

优选地，所述氨基酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，带有His-tag标签。胺脱氢酶序列如SEQ ID No.2所示，带有His-tag标签。苹果酸脱氢酶序列如SEQ ID No.3所示，带有His-tag标签。

进一步地，所述表面修饰后的羊毛采用尿素/硫化钠/十二烷基硫酸钠工艺进行表面处理制备得到，即将羊毛浸入在尿素、硫化钠和十二烷基硫酸钠的混合溶液中进行表面处理；其中，羊毛、尿素、九水合硫化钠与十二烷基硫酸钠的质量比为4～20：22～50：5～20：1.4～2。

优选地，所述羊毛的表面处理时间不能过长，以保留羊毛纤维骨架用于固定化。进一步优选地，所述表面处理的反应时间不超过2h。更进一步优选地，所述表面处理的反应时间为0.5～1.5h，羊毛骨架保留最完整且活性基团暴露最多使固定化酶负载量最高。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之二是：