[发明专利]一种高通量快速筛选高产咖啡酸菌种的方法

说明书

本发明公开了一种高通量快速筛选高产咖啡酸菌种的方法，属于生物工程技术领域。本发明的方法包括将待筛选的菌株进行发酵，得到发酵液；将所得发酵液离心获得发酵上清液；将发酵上清液置于多孔板；向发酵上清液中加入氯化铁反应液进行显色反应，使用全波长酶标仪检测680nm下的OD值；选取OD值高的咖啡酸生产菌株即可。本发明的高通量筛选方法可以大幅提高菌株的筛选效率，大幅增加单批次筛选的菌株数量，缩短咖啡酸高产菌株的筛选实验周期。

技术领域

本发明公开了一种高通量快速筛选高产咖啡酸菌种的方法，本发明属于生物工程技术领域。

背景技术

咖啡酸是一种天然酚酸类化合物，来源于植物中的苯丙氨酸途径。苯基丙酸，特别是咖啡因，由于其具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗病毒、抗糖尿病和抗抑郁等重要药理作用，越来越受到人们的关注。

然而由于咖啡酸在植物体中提取困难，成本高昂，无法满足工业生产需要。为了满足咖啡酸市场需求并实现高水平生产，己有研究人员利用代谢工程等手段使得大肠杆菌发酵生产咖啡酸，在发酵法咖啡酸的过程中，生产菌种的产酸能力是决定生产成本的关键一环,获得咖啡酸高产菌种十分重要，现有技术中通常采用高效液相色谱法逐一对发酵液中咖啡酸的含量进行检测，以筛选高产咖啡酸菌种，这种筛选过程耗时长、处理步骤繁琐、成本较高，很难实现高产咖啡酸菌种的高通量的筛选。

为了克服上述现有技术的不足，因此急需找到一种在大批量待测菌种中，能够高效、低成本、快速筛选出咖啡酸高产菌种的方法。

发明内容

本发明提供了一种高通量快速筛选高产咖啡酸菌种的方法，利用此方法，可以大幅提高菌株的筛选效率，大幅增加单批次筛选的菌株数量，缩短咖啡酸高产菌株的筛选实验周期。

本发明所采用的技术方案如下：

本发明提供的一种高通量快速筛选高产咖啡酸菌种的方法，所述方法具体包括：

将待筛选的菌株进行发酵培养，得到发酵液，离心获得发酵上清液；将所述发酵上清液转移至多孔板中，所述多孔板可以是常规的96微孔板或384微孔板，向发酵上清液中加入3价铁离子反应液进行显色反应后，再将发酵上清液放入全波长酶标仪中检测，检测出菌株对应的发酵上清液在680nm下的OD值，所得OD值即可反映相应菌株生产咖啡酸的能力，所述显色反应、OD值检测均在多孔板中进行，不需要进行发酵上清液的转移和重复取样。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述高通量快速筛选高产咖啡酸菌种的方法，以大肠杆菌作为工程底盘菌株，以香豆酸为底物进行发酵生产咖啡酸，需要说明的是，发酵底物中的成分对检测结果并不会产生干扰，发酵底物中的对香豆酸虽也能与氯化铁反应，但是对香豆酸与氯化铁反应呈黄褐色，咖啡酸与氯化铁反应呈墨绿色，通过反应产物的颜色也可初步判断待筛的菌株中的产咖啡酸菌株，也可通过所呈现的墨绿色深度初步判断咖啡酸的产量高低，且对香豆酸与氯化铁的反应产物在680nm下吸光度是极低的，因此，对香豆酸和咖啡酸虽然都能够与氯化铁反应显色，但是反应后两者的最大吸收波长不同，故在680nm下可完全排除对香豆酸的干扰；另外发酵液中葡萄糖浓度较低，加入显色剂后无明显颜色反应，即使50％高浓度的葡萄糖溶液与氯化铁反应显淡黄色，其在680nm处的OD值也极低；其他中间代谢物酪氨酸与氯化铁也不会有颜色反应。

本发明的一种较佳的实施方式中，所述发酵培养采用P-5052自动诱导培养基，于32～38℃、100～240rpm摇床中进行96深孔板震荡发酵培养，每升所述的P-5052自动诱导培养基含Na₂HPO₄ 50～60mM，KH₂PO₄ 50～60mM，(NH₄)₂SO₄ 20～30mM，MgSO₄ 2～3mM，甘油0.2％～0.5％，乳糖0.1％～0.2％，葡萄糖0.04％～0.05％，对香豆酸0.1～0.4mM，pH为7.0～7.4。