[发明专利]一种高通量快速筛选高产咖啡酸菌种的方法

权利要求书

1.一种高通量快速筛选高产咖啡酸菌种的方法，其特征在于，所述方法包括：将待筛选的菌株进行发酵培养，得到发酵液；将所得发酵液离心获得发酵上清液；将发酵上清液置微孔板中，向发酵上清液中加入3价铁离子反应液进行显色反应后，再将发酵上清液放入全波长酶标仪中检测，检测出菌株对应的发酵上清液在680nm下的OD值，所得OD值即可反映相应菌株生产咖啡酸的能力，选取OD值高的对应菌株作为高产咖啡酸菌种进行后续生产；

其中，待筛选的菌株是选择以香豆酸为底物进行发酵生产咖啡酸的大肠杆菌作为工程底盘菌株，发酵培养基为P-5052自动诱导培养基，每升培养基中含Na₂HPO₄50mM，KH₂PO₄50mM，(NH₄)₂SO₄25mM，MgSO42mM，甘油0.5％，乳糖0.2％，葡萄糖0.05％，对香豆酸0.3mM，pH为7.2，采用3价铁离子反应液为27.03g/L的FeCl₃·6H₂O进行显示反应，反应液加入量为上清体积的1/20。

2.根据权利要求1所述的一种高通量快速筛选高产咖啡酸菌种的方法，其特征在于，所述发酵培养于32～38℃、100～240rpm摇床中进行深孔板震荡发酵培养18～24h。

3.根据权利要求1所述的一种高通量快速筛选高产咖啡酸菌种的方法，其特征在于：所述发酵上清液是所述发酵液在14000rpm下离心2min后获得。

4.根据权利要求1-3中任意一项权利要求所述的一种高通量快速筛选高产咖啡酸菌种的方法，其特征在于，所述待筛选的菌株选自突变菌株文库，所述突变菌株文库构建方法包括：以羟化酶基因为模板，加入PCR引物对进行易错PCR扩增，获得目的基因片段，重组质粒后载入大肠杆菌中，构建突变菌株文库。

5.根据权利要求4所述的一种高通量快速筛选高产咖啡酸菌种的方法，其特征在于，所述羟化酶基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述羟化酶基因前后两端加有限制性内切酶Nde I和Not I酶切位点，具体如下所示：

Nde I：酶切序列及保护碱基：

Not I：酶切序列及保护碱基：

6.根据权利要求5所述的一种高通量快速筛选高产咖啡酸菌种的方法，其特征在于，所述PCR引物对的上游引物具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述PCR引物对的下游引物具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

7.根据权利要求1-3中任意一项权利要求所述的一种高通量快速筛选高产咖啡酸菌种的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：建立咖啡酸产量与OD值对应关系的标准曲线、将待筛选菌株发酵上清液测得OD值代入标准曲线获得相应菌株的咖啡酸产量值。