[发明专利]治疗苯丙酮尿症的工程益生菌及其构建方法与应用

说明书

本发明涉及医药领域和生物技术领域，具体涉及治疗苯丙酮尿症的工程益生菌及其构建方法与应用；所述重组表达载体包括重组表达载体一和重组表达载体二；所述重组表达载体一为包含苯丙氨酸氨裂合酶基因PAL核苷酸序列、蛋白质分泌加工结构域编码基因prtP核苷酸序列和嗜酸乳杆菌组成型启动子SL的表达载体；所述重组表达载体二为包含苯丙氨酸氨裂合酶基因PAL核苷酸序列，苯丙氨酸转运泵基因pheP和嗜酸乳杆菌组成型启动子SL的表达载体；首次构建在胃肠道中能够分泌苯丙氨酸氨裂合酶到菌体外的工程益生菌，有效降解胃肠道中被消化食物中的苯丙氨酸，降低患者的苯丙氨酸摄取量，用于治疗PKU。

技术领域

本发明涉及医药领域和生物技术领域，具体涉及治疗苯丙酮尿症的工程益生菌及其构建方法与应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

苯丙酮尿症PKU是一种先天性的苯丙氨酸代谢障碍疾病，目前针对苯丙酮尿症患者的唯一临床疗法是采取低苯丙氨酸PA饮食的策略，在婴儿期喂养低PA奶粉，在幼儿期和成人期遵循低蛋白饮食，控制苯丙氨酸摄取量；但是严格的低蛋白饮食治疗策略对青少年发育和成人都有极大的副作用，影响病人的生理和心理健康，患者生活质量差，依从性低。

目前，还有一些在实验阶段的PKU治疗策略，例如，将携带苯丙氨酸羟化酶PAH基因的腺病毒载体感染小鼠，恢复小鼠肝脏PAH活性，但该方案存在基因疗法的普遍缺陷；利用大肠杆菌表达重组PAH，口服后降低血液PA浓度，但重组PAH蛋白在口服后已被消化道中蛋白酶分解。另外，现有技术中利用大肠杆菌工程益生菌治疗PKU的方案中将苯丙氨酸解氨酶基因和苯丙氨酸转运泵基因整合到大肠杆菌基因组上构建大肠杆菌工程益生菌，制成菌剂经口服进入患者肠道，工程菌从肠道中将苯丙氨酸吸收到菌体内，然后在苯丙氨酸解氨酶的作用下降解PA，从而减少患者PA摄取量。但是，现有治疗苯丙酮尿症大肠杆菌工程菌主要定植于大肠，此外现有的大肠杆菌工程菌需要将苯丙氨酸吸收到菌体内才能发挥降解苯丙氨酸的作用，限制了工程菌对苯丙氨酸的降解效率。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供了治疗苯丙酮尿症的工程益生菌及其构建方法与应用，通过基因工程技术手段改造嗜酸乳杆菌，构建出能够表达苯丙氨酸氨裂合酶和苯丙氨酸转运泵，同时将苯丙氨酸氨裂合酶分泌到菌体外的嗜酸乳杆菌工程益生菌，使工程益生菌在胃肠道中持续分泌苯丙氨酸氨裂合酶，经动物实验证明能降低苯丙酮尿症小鼠血液PA浓度，有潜力开发成用于治疗PKU的工程益生菌。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下所述：

在本发明的第一方面，提供一种重组表达载体，包括重组表达载体一和重组表达载体二；

所述重组表达载体一为包含苯丙氨酸氨裂合酶基因(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)核苷酸序列、蛋白质分泌加工结构域编码基因prtP核苷酸序列和嗜酸乳杆菌组成型启动子SL的表达载体；

所述重组表达载体二为包含苯丙氨酸裂合酶基因PAL核苷酸序列，苯丙氨酸转运泵基因(phenylalanine transporter，pheP)和嗜酸乳杆菌组成型启动子SL的表达载体。

优选地，所述苯丙氨酸氨裂合酶基因PAL来源于Photorhabdus asymbioticaATCC43949，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，所述蛋白质分泌加工结构域编码基因prtP来源于Lacticaseibacillusparacasei ATCC 334，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选地，所述苯丙氨酸转运泵基因pheP来源于Escherichia coli K-12，核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。