[发明专利]一种结核分枝杆菌的MNP标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种结核分枝杆菌的MNP标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用，所述MNP标记组合包括AL123456基因组上MNP‑1～MNP‑17的标记，具体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.17所示。所述引物对组合核苷酸序列如SEQ ID NO.18‑SEQ ID NO.51所示。所述MNP标记组合能特异的鉴定结核分枝杆菌并精细的区分不同的变种；所述引物互不干扰，综合多重扩增和测序技术，可一次性对多样本的所有标记组合进行序列分析，具有高通量、多靶点、高灵敏、高准确性和免培养的技术优势，可应用于大规模样本的结核分枝杆菌的精细鉴定、遗传变异检测和指纹数据库构建等，对结核分枝杆菌的监测、防治和科研具有重要意义。

技术领域

本发明实施例涉及生物技术领域，特别涉及一种结核分枝杆菌的MNP标记组合、引物 对组合、试剂盒及其应用。

背景技术

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)，俗称结核杆菌。结核分枝杆菌可通过呼吸 道、消化道或皮肤损伤侵入易感机体，引起多种组织器官的结核病。结核分枝杆菌可通过 飞沫微滴或含菌尘埃的吸入，故以肺结核较为多见。结核病是一种世界性疾病,为最受关注 的公共卫生问题之一。虽然近年来随着疫苗的产生和对儿童的早期接种，结核病的发病率 呈下降趋势，但其对人类健康造成的危害仍十分严峻。快速、准确的结核分枝杆菌的检测、上报是结核病防控的重要环节之一，是控制结核病发病和流行的基础。

结核分枝杆菌是典型的病原微生物，也是实验室经常研究的病原微生物。实验微生物 的遗传变异会导致不同实验室或同一实验室不同时期相同命名的菌株遗传上实际并不相 同，从而导致实验结果的不可重现和不可比较。对人hella细胞在成果发表前进行认证已达成共识。因此对病原微生物的检测不仅要能灵敏准确的检出结核分枝杆菌，还要能够检测 群体中的低频率的变异，这对现有的检测技术是个挑战。

经典的结核分枝杆菌检测方法，包括分离培养、PCR技术、全基因组和宏基因组测序 等，在时长、操作复杂度、检测通量、检测变异的准确性和灵敏度、成本等方面存在一个或多个局限。融合超多重PCR扩增和高通量测序的靶向分子标记检测技术，可以在低微生物含量的样本中靶向的富集目标微生物，避免了全基因组的病原菌分离培养步骤和宏基因组测序带来的大量数据浪费和背景噪音，具有样本需要量少、诊断结果精确，节约数据量、检测低频变异的优势。

现有的靶向检测技术检测的分子标记主要包括SNP和SSR标记。SSR标记是公认的多 态性最高的标记，但在微生物中数量少；SNP标记数量巨大，分布密集，是二态性标记，单个SNP标记的多态性不足以捕获微生物种群中潜在的等位基因多样性。因此，开发高多态性的新型分子标记及其检测技术，成为亟待解决的技术问题。

本发明开发物种特异的新型分子标记-MNP标记。MNP标记是指在基因组上一段区域 内由多个核苷酸引起的多态性标记。与SSR标记和SNP标记相比，MNP标记具有以下优势：(1)等位基因型丰富，单个MNP标记上有2ⁿ种等位基因型，高于SSR和SNP；(2)物 种区分能力强，只需要少量的MNP标记就能实现物种及其以下分类水平的鉴定，物种鉴定 精细。基于超多重PCR结合二代高通量测序技术检测MNP标记的MNP标记法具有以下优 势：(1)输出的是碱基序列，无需平行实验，可构建标准化的数据库进行共享共用；(2)高 效率，利用样品DNA条形码，突破测序样品数量的局限，可一次性对成百上千份样本的数 万个MNP标记分型；(3)高灵敏度，利用多重PCR一次检测多个靶标，避免单个靶标扩 增失败导致高的假阴性和低的灵敏度；(4)高准确性，利用二代高通量测序仪对扩增产物测序数百次。

鉴于以上优点和特性，MNP标记及其检测技术MNP标记法可实现群体生物多等位基因型的分类与溯源，在病原微生物的鉴定、指纹数据库构建、遗传变异检测等方面都具有应用潜力。目前在微生物中，尚未有关于MNP标记的报道，也缺乏相应的技术。MNP标 记法的开发、筛选和应用在植物中具有较好的应用基础。